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Actin（肌動(dòng)蛋白）是細(xì)胞骨架蛋白的重要組成蛋白之一，分子量為43kDa，在物種之間高度保守。根據(jù)Actin的功能和組織定位的不同，主要分為三類：α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和γ-膜肌動(dòng)蛋白(γ-smooth muscle actin)。
1）α-actin存在于肌肉組織中，包括平滑肌和心肌，參與了細(xì)胞的收縮和肌肉運(yùn)動(dòng)；
2）β-actin廣泛存在于細(xì)胞各個(gè)部位，包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架，它參與了多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分裂；
3）γ-smooth muscle actin主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞，參與平滑肌收縮和組織修復(fù)。
其中，β-actin常被用作內(nèi)參蛋白，從而被大家所熟知，它可以作為實(shí)驗(yàn)中蛋白負(fù)載量和表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)參照物。在WB實(shí)驗(yàn)過程中，通過檢測(cè)和對(duì)比目標(biāo)蛋白與β-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，可以對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量和比較。然而，Actin的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止內(nèi)參蛋白那么簡(jiǎn)單，根據(jù)Nature、Science、Cell等zhi名期刊上發(fā)布的相關(guān)研究結(jié)果表明，它在囊泡運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移、吞噬和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬镞^程和疾病研究中都發(fā)揮著重要的功能作用。接下來，就和大家一起來聊聊關(guān)于Actin那些你不知道的事兒~
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一、Actin的研究方案
1、肌動(dòng)蛋白聚合物的檢測(cè)
在生理?xiàng)l件下，球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)很容易聚合成絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)，同時(shí)發(fā)生ATP水解（圖1）。肌動(dòng)蛋白在體外可以從兩端聚合，由于聚合速度快慢的差異，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲具有內(nèi)在極性，我們通常將聚合速度快的一端稱為正端或倒鉤端，而聚合速度慢的那一端稱為負(fù)端或jian端。
圖1 肌動(dòng)蛋白絲的雙螺旋結(jié)構(gòu)
肌動(dòng)蛋白的聚合取決于肌動(dòng)蛋白單體對(duì)細(xì)絲末端的親和力，肌動(dòng)蛋白單體存在一個(gè)臨界濃度(CC)，當(dāng)?shù)陀谠摑舛?，肌?dòng)蛋白不會(huì)聚合；當(dāng)單體濃度高于CC時(shí)，肌動(dòng)蛋白將發(fā)生聚合，直到游離單體濃度等于CC。然而，當(dāng)我們?cè)隗w外研究肌動(dòng)蛋白時(shí)，它的程度則取決于所使用的條件。舉個(gè)例子，在4°C條件下，肌動(dòng)蛋白在2mM Mg2+和50mM KCl溶液中的CC值為0.03mg/mL，當(dāng)這些離子不存在時(shí)，CC值則會(huì)超過3.0mg/mL。因此，我們可以通過改變離子類型和濃度，來改變聚合物的數(shù)量。
通過檢測(cè)肌動(dòng)蛋白聚合物，可以評(píng)估不同化合物對(duì)肌動(dòng)蛋白功能的影響，目前常用的檢測(cè)方法有以下4種：
1）芘結(jié)合熒光法
較通用、較靈敏、最易于操作的檢測(cè)方法，對(duì)照樣本和測(cè)試樣本與少量芘連接的肌動(dòng)蛋白混合，然后用熒光計(jì)跟蹤聚合情況。芘肌動(dòng)蛋白單體與聚合物結(jié)合后，熒光信號(hào)增強(qiáng)高達(dá)20倍。肌動(dòng)蛋白聚合分為三個(gè)階段，就像微管組裝一樣，這三個(gè)階段分別是成核、生長(zhǎng)和穩(wěn)態(tài)。聚合的程度可由穩(wěn)定狀態(tài)的熒光水平來表示，加入phalloidin（鬼筆環(huán)肽）可測(cè)量出上限，將CC降至0.01mg/mL以下。這種檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率超過95%，并且在檢測(cè)過程中不會(huì)干擾樣品。
圖2 通過芘肌動(dòng)蛋白熒光測(cè)量肌動(dòng)蛋白的聚合情況
2）DNase酶抑制法
DNase酶抑制法是基于G-actin與DNase 1之間高親和力的相互作用，從而抑制DNase的活性。這種檢測(cè)方法的大優(yōu)勢(shì)在于它能區(qū)分G-actin和F-actin，因此，它通常被用于選擇性地測(cè)定細(xì)胞提取物中單體和絲狀肌動(dòng)蛋白的量。此外，DNase酶抑制法還可以用于研究從肌動(dòng)蛋白絲生成G-actin的結(jié)合蛋白。
3）粘度檢測(cè)法
根據(jù)需要檢測(cè)的聚合物差異性，粘度檢測(cè)法可以分為高剪切或低剪切測(cè)量。如果是想測(cè)量短(1µm)和中(3-5µm)肌動(dòng)蛋白絲之間的微小差異，那么可以選擇高剪切法；如果要確定長(zhǎng)絲樣本的差異，則需要使用低剪切法。雖然粘度檢測(cè)法能很好地比較兩個(gè)樣品之間的細(xì)絲交聯(lián)情況，但最大的缺點(diǎn)是需要儀器設(shè)備、剪切細(xì)絲不太準(zhǔn)確，并且當(dāng)在測(cè)量肌動(dòng)蛋白組裝的方法時(shí)會(huì)干擾反應(yīng)。
4）Spin-down實(shí)驗(yàn)
Spin-down檢測(cè)法的原理是利用沉降差異來分離F-actin和G-actin，由于檢測(cè)時(shí)間有限，這種方法的主要用途是獲得穩(wěn)定狀態(tài)下肌動(dòng)蛋白聚合物的定量值。該方法可與芘結(jié)合熒光法或DNase酶抑制法聯(lián)合使用，以定量測(cè)定反應(yīng)時(shí)間過程中肌動(dòng)蛋白聚合物的數(shù)量。由于這種方法對(duì)待測(cè)樣品具有破壞性，因此只有在對(duì)樣品進(jìn)行了所有其他測(cè)量方法后才能使用。這種檢測(cè)方法還存在另一個(gè)缺點(diǎn)，那就是小的肌動(dòng)蛋白寡聚體不會(huì)沉淀，因此定量值可能會(huì)高于實(shí)際上清液中肌動(dòng)蛋白單體的數(shù)量。
至于選擇哪種方法來檢測(cè)肌動(dòng)蛋白聚合物，則取決于實(shí)驗(yàn)室可用的設(shè)備和所需的靈敏度，也為大家總結(jié)了這四種方法的對(duì)比，供大家參考選擇：
檢測(cè)方法 | 原理 | 優(yōu)勢(shì) | 缺點(diǎn) |
芘結(jié)合熒光法 | 基于聚合過程中芘結(jié)合肌動(dòng)蛋白的增強(qiáng)熒光 | 通用性強(qiáng)；靈敏度高；易于操作 | 需要儀器(熒光光度計(jì)) |
DNase酶抑制法 | 基于G-actin與DNase 1之間高親和力的相互作用 | 能夠區(qū)分G-actin和F-actin | 結(jié)果重復(fù)性可能會(huì)有10-20%的差異 |
粘度檢測(cè)法 | 通過剪切微絲來檢測(cè)的聚合物差異性 | 能很好地比較兩個(gè)樣品之間的細(xì)絲交聯(lián)情況 | 需要儀器設(shè)備；剪切細(xì)絲不太準(zhǔn)確；有干擾反應(yīng) |
Spin-down實(shí)驗(yàn) | 利用沉降差異來分離F-actin和G-actin | 可與其它方法聯(lián)合使用；易于操作 | 對(duì)待測(cè)樣品具有破壞性；定量值不夠準(zhǔn)確 |
表1 肌動(dòng)蛋白聚合物的檢測(cè)方法對(duì)比
2、肌動(dòng)蛋白的染色
肌動(dòng)蛋白另一個(gè)重要的研究方案，就是它在細(xì)胞或組織中的熒光成像，最常見熒光染料是鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)物(phalloidins)。鬼筆環(huán)肽，又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)中分離到的一種七肽毒素，以ji高的親和力和特異性結(jié)合F-actin，不會(huì)結(jié)合G-actin。鬼筆環(huán)肽對(duì)大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細(xì)胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計(jì)量比結(jié)合。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。此外，還有上文提到的，鬼筆環(huán)肽使得肌動(dòng)蛋白聚合CC值降至1μg/mL，可用作一種聚合增強(qiáng)劑，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細(xì)胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。
由于熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽不具有細(xì)胞透性，因此多用于固定細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白染色。帶正電或負(fù)電的熒光染料會(huì)通過非特異性的離子相互作用與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致產(chǎn)生更高的背景；Actin-stain系列的鬼筆環(huán)肽熒光探針是非離子型的，因此更有助于獲得理想的低背景結(jié)果。
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3、肌動(dòng)蛋白的翻譯后修飾
目前，關(guān)于肌動(dòng)蛋白的翻譯后修飾(PTM)研究也越來越多，PTM是高度動(dòng)態(tài)且通常可逆的過程，其中蛋白質(zhì)的功能特性能夠通過在其氨基酸殘基上添加化學(xué)基團(tuán)或另一種蛋白質(zhì)而改變。肌動(dòng)蛋白是PTMs的主要底物，它可以經(jīng)歷至少17個(gè)PTMs，包括ADP-ribosylation、arginylation、dimethylation、phosphorylation、oxidation、nitration、O-GlcNAcylation、ubiquitination、SUMOylation、acetylation、carbonylation、isaspartylation、transglutamination、malonylation、glutathionylation、nitrosylation、crosslinking/isopeptide bonding。在研究翻譯修飾后的肌動(dòng)蛋白時(shí)，常用到的就是生物素肌動(dòng)蛋白，它是一種具有多種用途的衍生物，可與鏈霉親和素結(jié)合使用，作為細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)的探針。生物素肌動(dòng)蛋白還可用于體外檢測(cè)，標(biāo)記肌動(dòng)蛋白或使用鏈霉親和素磁珠從復(fù)雜的混合物中選擇性地純化肌動(dòng)蛋白。
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二、Actin的最新研究進(jìn)展
最新研究表明，衰老會(huì)導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白表達(dá)和動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化，從而引發(fā)多種與年齡相關(guān)的疾病，包括癌癥、血管疾病和神經(jīng)退行性疾病1。對(duì)酵母的研究發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)營(yíng)養(yǎng)代謝甚至決定壽命都至關(guān)重要2。
研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量都會(huì)下降，從35歲到更年期，生育能力會(huì)明顯下降。能量代謝是導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的機(jī)制之一3，其中肌動(dòng)蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖至關(guān)重要，肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的變化會(huì)直接影響與年齡相關(guān)的生育能力和生殖結(jié)果。
1、肌動(dòng)蛋白在減數(shù)分裂中的作用
哺乳動(dòng)物的單倍體卵子由二倍體卵母細(xì)胞通過減數(shù)分裂發(fā)育而成，受精后，卵子進(jìn)行第二次染色體分裂，分離姐妹染色單體，染色體和隨后姐妹染色單體的分離取決于紡錘體的功能。紡錘體由微管組成，而微管由微管蛋白亞基構(gòu)成。紡錘體微管負(fù)責(zé)染色體排列，以促進(jìn)分裂。最近的研究表明，除微管蛋白外，紡錘體肌動(dòng)蛋白對(duì)紡錘體的正常功能也至關(guān)重要4。紡錘體肌動(dòng)蛋白有助于將微管捆綁成功能性k纖維，而紡錘體肌動(dòng)蛋白缺失則會(huì)導(dǎo)致k纖維穩(wěn)定性降低和染色體分離錯(cuò)誤5。除了紡錘體的功能外，肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)對(duì)細(xì)胞分裂也至關(guān)重要，因?yàn)榧?dòng)蛋白會(huì)形成一個(gè)收縮環(huán)，將新形成的子細(xì)胞分開。減數(shù)分裂和受精之后，新形成的胚胎進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞有絲分裂所需的紡錘體微管與減數(shù)分裂紡錘體微管的不同之處在于，它是從中心體上成核的。因此，肌動(dòng)蛋白還參與了有絲分裂，而不僅僅局限于減數(shù)分裂，這凸顯了肌動(dòng)蛋白在胚胎發(fā)育過程中的重要性6。
2、與年齡相關(guān)非整倍體的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)
在分離之前，同源染色體通過黏連蛋白固定在一起，與此同時(shí)，姐妹染色單體在其中心粒上仍被黏連蛋白結(jié)合。在減數(shù)第一次分裂過程中，同源染色體之間的黏連蛋白被裂解，但姐妹染色單體之間的黏連蛋白受到保護(hù)。姐妹染色單體的過早分離會(huì)導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤，造成卵子中染色體數(shù)目不正確，從而產(chǎn)生非整倍體7。
在人類中，最常見的非整倍體導(dǎo)致的疾病是三體綜合征，比如21-三體綜合征（也叫唐氏綜合征）和克氏綜合征(47，XXY)。在高齡產(chǎn)婦中，非整倍體的發(fā)生率較高，造成這一現(xiàn)象的可能原因是衰老卵母細(xì)胞中黏連蛋白的耗竭8。然而，Dunkley和Mogessie認(rèn)為，僅靠黏連蛋白的耗竭并不能wan全解釋非整倍體迅速增加的原因，就在去年，他們的研究揭示了肌動(dòng)蛋白能夠有效降低與年齡相關(guān)的卵子非整倍體的發(fā)生9。結(jié)果表明，F(xiàn)-actin負(fù)責(zé)在衰老卵子的黏連蛋白耗竭后維持姐妹染色單體的結(jié)合，此外，破壞年輕卵子中的F-actin會(huì)導(dǎo)致與衰老卵子類似的染色體過早分離。為了證實(shí)這一作用，他們還發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的F-actin可減少衰老卵子中染色體的過早分離，更重要的是，這些結(jié)果都有依賴于肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)。作者推測(cè)，F(xiàn)-actin可能抵消了紡錘體微管的拉力。
圖3 破壞F-actin會(huì)加速幼卵中類似衰老的染色體過早分離(Dunkley et al. 2023)
3、衰老表觀基因組和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)
表觀遺傳變化是指在不改變基因本身的情況下導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化的修飾，這些改變包括甲基化、乙?；⒘姿峄?span id="a2keuky" class="">Sumo化，可在DNA、RNA和組蛋白上被發(fā)現(xiàn)10。DNA甲基化是衰老的一種生物標(biāo)志物，能夠確定組織在整個(gè)生命周期中的年齡11。
白藜蘆醇(resveratrol)是一種存在于葡萄皮和紅葡萄酒中的多酚，一直以來都被認(rèn)為是抗衰老劑和對(duì)多種疾病有益的補(bǔ)充劑12。根據(jù)臨床前的動(dòng)物研究，白藜蘆醇能夠改善生殖衰老13-14。一些研究強(qiáng)調(diào)，人類的生育能力仍存在很多未知數(shù)15，并且白藜蘆醇在生殖衰老中的作用機(jī)制仍不甚明了。
最近，白藜蘆醇能改善雌性小鼠生殖能力的機(jī)制終于被證實(shí)了，它能逆轉(zhuǎn)與衰老相關(guān)的基因表達(dá)變化，并減少衰老卵母細(xì)胞的整體甲基化16。在比較年輕小鼠、中年小鼠和老年小鼠的卵母細(xì)胞時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)的基因，主要是許多參與肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)過程的基因表達(dá)下調(diào)。白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)了衰老卵母細(xì)胞的這種效應(yīng)，消除了肌動(dòng)蛋白相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，并恢復(fù)了它們的表達(dá)。
綜上所述，在卵子形成和胚胎發(fā)育過程中，肌動(dòng)蛋白對(duì)正常的減數(shù)分裂和有絲分裂至關(guān)重要。此外，有跡象表明肌動(dòng)蛋白直接參與染色質(zhì)重塑17，這一點(diǎn)仍有待在生殖衰老的背景下進(jìn)行探索。
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Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
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