背景介紹

糖代謝是細胞能量合成的主要方式，是維持機體生命活動的基礎(chǔ)。在氧氣充足的環(huán)境中，正常細胞通過葡萄糖氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)途徑產(chǎn)能，1mol葡萄糖氧化后可生成36mol ATP。在無氧環(huán)境下，葡萄糖經(jīng)無氧糖酵解代謝轉(zhuǎn)化為乳酸，1mol葡萄糖僅能產(chǎn)生2mol ATP。1927年Warburg先發(fā)現(xiàn)肝癌細胞相比其他細胞具有更高的葡萄糖攝取率及增強的糖酵解反應(yīng)為腫瘤細胞增殖提供主要能量的現(xiàn)象。隨后研究發(fā)現(xiàn)相較于OXPHOS，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞普遍傾向于有氧糖酵解為其供能，并稱這一轉(zhuǎn)變?yōu)椤癢arburg效應(yīng)"。

有氧糖酵解是在細胞質(zhì)中進行的，在有氧情況下，1mol葡萄糖被糖酵解代謝為2mol丙酮酸，并獲得2mol ATP，而后丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下被還原成乳酸，獲得另外2mol ATP。雖然單分子葡萄糖的有氧糖酵解產(chǎn)能量低，但其反應(yīng)步驟少、產(chǎn)能速度高，總產(chǎn)能量大，更加可以滿足腫瘤細胞快速增殖的能量需求中。這一現(xiàn)象目前已認為不僅是腫瘤細胞的標志特征之一，增殖細胞及其他體外轉(zhuǎn)化細胞也能夠通過有氧糖酵解調(diào)整其能量和底物需求以應(yīng)對不斷變化的環(huán)境條件^[1]。

抑制糖酵解過程在治療前列腺癌研究中的應(yīng)用

2024年2月8日，武漢市中心醫(yī)院泌尿外科昌磊副主任醫(yī)師研究團隊在Cell Communication and Signaling雜志上發(fā)表了題為“1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis"的研究論文。他們的研究表明，P5C通過靶向SHP1/PKM2/LDHB復(fù)合體來抑制T細胞的糖酵解過程。研究結(jié)果為制備抗P5C抗體提供了機制基礎(chǔ)，該抗體可用于恢復(fù)T細胞糖酵解和抑制前列腺癌的生長。

圖 SHP1、PKM2和LDHB相互結(jié)合，P5C抑制T細胞糖酵解^[2]。

注：糖酵解相關(guān)生化檢測指標：丙酮酸激酶(PK, abs580073)、乳酸(LA, abs580160)、乳酸脫氫酶(LHD, abs580007)

接下來，小愛就以糖酵解系列試劑盒中的丙酮酸激酶檢測試劑盒為例，給大家詳細介紹使用方法。

丙酮酸激酶檢測試劑盒使用方法介紹

一、試劑盒組分

二、操作步驟：

1、材料和試劑準備

自備材料：酶標儀、蒸餾水、移液器與槍頭、研缽、離心機、計時器、濕冰等。

Substrate：使用前加入18mL Reaction Buffer溶解。

Enzyme：使用前加入1mL Assay Buffer 溶解。

Standard：使用前加入1mL蒸餾水溶解，然后取0.2mL加入到0.8mL蒸餾水中，獲得濃度為400μmol/L的標準品溶液。

Positive Control：使用前加入0.5mL蒸餾水溶解。

2、樣本處理

1）細胞/細菌樣本：將細胞/細菌(5×10⁶)收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）后于4℃，8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測；

2）組織樣本：稱取1g組織，加入1mL Assay buffer在濕冰上勻漿，4℃，8000g離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，濕冰上保存待檢測；

3）血清/血漿樣本：直接檢測。

3、上樣及檢測

上樣前將所有試劑加熱至37℃，然后按照如下表格加樣。

注：

1）對于標準品，可進行2倍連續(xù)稀釋（6個點左右），制成標準曲線。

2）對于未知的樣品，我們建議挑選幾個樣品進行預(yù)實驗，以確定樣品濃度和稀釋倍數(shù)。如果酶活力較低，請向反應(yīng)體系中加入更多的樣品，或增加反應(yīng)時間；如果酶活力較高，請稀釋樣品，或減少反應(yīng)時間。

4、標準曲線

標準曲線僅用于參考，每次實驗都必須做一條新的標準曲線。

檢測范圍：4μmol/L - 400μmol/L

降低濃度的陽性對照示例

常見問題解答

Q1：試劑盒中的96-Well Microplate只有一個，不夠?qū)嶒炇褂迷趺崔k？

A1：該試劑盒中的96孔板是免費送的，后續(xù)實驗可以用常規(guī)的96孔酶標板代替。

Q2：試劑盒操作說明書中既有標準曲線法又有公式法，我應(yīng)該選擇哪種計算方式？

A2：兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法，建議按照標曲計算，會更加準確。需要注意的是，使用標準曲線法，每次實驗必須重新繪制標準曲線。

Q3：試劑盒中的陽性對照需要和標準曲線一樣每次都做嗎？

A3：陽性對照不需要每次都做，可以在實驗時做以幫助您確認試劑盒是否有問題。當(dāng)然，也有老師每次做實驗都會做陽性對照，以便在實驗數(shù)據(jù)不正常時排查實驗?zāi)睦锍隽藛栴}。

[1] 楊柳易,王琛.有氧糖酵解對腎臟疾病影響的研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2022,23(8):744-746.
[2] Chang L, Li G, Jiang S, et al. 1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis[J]. Cell Commun Signal. 2024;22(1):101. Published 2024 Feb 8. doi:10.1186/s12964-024-01493-1

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