背景

核糖核酸(RNA)是生命科學“中心法則"的三大核心分子之一，它主要以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉(zhuǎn)錄形成的一條單鏈分子。RNA的主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁。

圖 中心法則

RNA根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，又可以分為mRNA、rRNA、tRNA以及一些小分子RNA等。

表1 不同種類RNA

RNA提取

核酸提取在核酸分子檢測領域是及其關鍵的一步。對于RNA提取方法研究，具有較為悠久的發(fā)展歷史，形成了多種總RNA提取方法，如異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法（Trizol抽提法）、堿裂解法、柱層析法、磁珠法等。

1）柱層析法：通過特殊的硅膜柱吸附RNA，通過洗脫實現(xiàn)RNA的提取。這種方法操作簡單、核酸提取得率高，是目前實驗室常用的RNA提取方法；

2）磁珠法：采用吸附RNA，通過磁場來分離RNA。這種方法操作簡單，且可以實現(xiàn)全自動核酸提取，非常適合大批量RNA提取。

各種提取方法各有優(yōu)缺點，需根據(jù)不同樣本類型以及實驗需求來選擇。

愛必信明星產(chǎn)品Trizol(abs60154)是基于異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法的細胞或組織總RNA抽提試劑，對動植物細胞或組織及細菌的總RNA抽提均適用。提取所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為1.8-2.0，同時可以保持樣本中RNA的完整性，適用于多種下游實驗。

產(chǎn)品優(yōu)點

1）操作簡單快速；
2）能抽提多種屬總RNA；
3）能抽提不同分子量大小的多種RNA；
4）能夠避免DNA和蛋白的污染；
5）RNA得率高、純度高；
6）抽提出來的RNA適用于多種實驗。

圖 Trizol(abs60154)引用文獻展示

經(jīng)常會有客戶來咨詢是否能用Trizol進行血液RNA提取，本期給大家介紹下以Trizol法提取血液樣本RNA實驗操作。

實驗原理

Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA則分布在上層的水相中，最后用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，這樣就可以得到比較純凈的總RNA。 

圖 Trizol提取RNA流程圖

實驗步驟

1、所需試劑、耗材設備

Trizol(abs60154)、無酶無菌水(abs9259)、氯仿、異丙醇、75%乙醇、無菌無酶離心管(abs7119)、無菌無酶吸頭(abs7072、abs7075、abs7081)、低溫離心機

1）取300-500μL新鮮全血加入裝有1mL Trizol的2mL離心管中（樣品體積一般不超過Trizol體積的10%），充分吹打均勻；
2）室溫靜置5min，使核酸蛋白質(zhì)復合物分離。（此時的樣品可在-80℃冰箱中長期保存）；
3）每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；
4）4℃ 12000xg離心15min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相，中間層和無色的上層水相；
5）吸取含總RNA的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所加Trizol試劑的60％；
6）按照每1mL Trizol的最初使用量加入0.5mL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置10min；
7）4℃ 12000xg離心10min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀；
8）按照每1mL Trizol的最初使用量加入1mL 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀；
9）4℃ 12000xg離心5min，棄除上清；
10）室溫倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免RNA過干，難以溶解）；
11）加入適量（如25uL）無酶無菌水(abs9259)或TE緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解RNA；
12）所得的RNA應立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復凍融。

注：對于其他樣本如動植物細胞、組織、酵母細胞以及細菌請參考愛必信說明書

2、RNA質(zhì)量檢測方法

為了保證下游分子生物學實驗的正常進行，需要對提取好的RNA質(zhì)量進行檢測。一般需要檢測RNA純度、濃度、完整性。

3、RNA濃度檢測

可以使用NanoDrop超微量分光光度計和Qubit系列熒光計檢測提取的RNA濃度。使用分光光度計檢測可以記錄各RNA樣品的濃度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。RNA的濃度是衡量所提取的RNA質(zhì)量高低的重要標準，若RNA的濃度較低，則影響后續(xù)分子生物學試驗。

4、RNA純度檢測

RNA的OD值是衡量RNA純度高低的一個重要指標，較為理想的總RNA的OD260/OD280比值應為1.8~2.1，當OD260/OD280的值小于1.8時，說明RNA中存在較多的污染，這種污染可能是蛋白質(zhì)或者其他雜質(zhì)。當OD260/OD280的值大于2.2時，說明RNA已部分降解。OD260/OD230的值作為參考，一般大于2.0較好。若OD260/OD230的值低于2.0，則說明提取的RNA有污染，這種污染一般來自蛋白質(zhì)、鹽類或次生代謝物。

5、RNA完整性檢測

取提取的RNA樣品5µL，與1µL 5×RNA Loading Buffer混勻后，在100-120V電壓條件下，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳30min。電泳結(jié)束后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢查RNA電泳條帶的完整性。

瓊脂糖凝膠電泳條帶的質(zhì)量是評估提取的總RNA完整性快捷的方法，一般電泳條帶的亮度與提取的RNA濃度成正比。對于真核生物樣品，完整的總RNA在進行變性凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的28S和18S rRNA條帶，兩條帶的亮度比約為2:1，并且可以觀察到5S rRNA條帶。

圖 總RNA電泳結(jié)果

其他RNA提取產(chǎn)品

為了滿足不同客戶分子實驗需求，愛必信研發(fā)有針對不同樣本如動植物組織和細胞、血液、病毒、微生物的RNA提取試劑盒，同時進行了RNA提取方法學區(qū)分。我們擁有的優(yōu)勢有：

1）產(chǎn)品種類豐富；
2）產(chǎn)品安全性高；
3）RNA提取純度高；
4）RNA提取得率高；
5）操作簡便快捷；
6）專業(yè)售前售后技術(shù)支持。

對于特殊、珍貴樣本，我們建議選擇用針對不同樣本類型的專項試劑盒。可以根據(jù)以下表格指南進行選擇。

表 RNA提取試劑盒選擇指南

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WB相關：ECL發(fā)光液、預染marker、預制膠；IHC相關：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...