概述

近年來使用3D腫瘤球&腫瘤類器官模型在大型化合物庫中的高通量藥物篩選、檢測(cè)單藥或多藥濃度等方面，展現(xiàn)出能夠幫助研究者快速篩選出藥物敏感性強(qiáng)、反應(yīng)性好、效果優(yōu)的癌癥適應(yīng)癥藥物的能力。在2D細(xì)胞藥敏活性檢測(cè)中，CCK8法應(yīng)用廣泛，然而在3D腫瘤球&腫瘤藥物敏感活性中，ATP熒光法比CCK8法檢測(cè)更準(zhǔn)確，今天小愛帶大家了解檢測(cè)攻略。

ATP生物發(fā)光技術(shù)原理

本試劑盒采用生物發(fā)光(bioluminescent)法，利用Firefly luciferase（螢火蟲熒光素酶）催化底物—熒光素的轉(zhuǎn)化，高效利用ATP的能量，發(fā)射出光子。發(fā)光信號(hào)與存在的ATP量呈正比，而ATP與存在于類器官中的細(xì)胞數(shù)目直接呈正比，有效檢測(cè)3D腫瘤球&類器官活性。

本試劑盒為多孔板而設(shè)計(jì)，是進(jìn)行自動(dòng)化高通量篩選(HTS) ，3D腫瘤球&類器官增殖和毒性分析的理想選擇。均質(zhì)檢測(cè)步驟就是將單一試劑直接加入含有類器官培養(yǎng)基的孔板中，無需去除基質(zhì)膠。

均質(zhì)檢測(cè)的"加樣-混合-檢測(cè)" 的操作方案使得3D腫瘤球&類器官裂解和產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)與存在的ATP量成正比，而ATP量直接與類器官中的細(xì)胞數(shù)量成正比。特殊的均質(zhì)檢測(cè)方案避免了那些需要多個(gè)步驟的ATP檢測(cè)方法可能會(huì)引入的誤差。

產(chǎn)品組成

注意：產(chǎn)品建議現(xiàn)配現(xiàn)用

產(chǎn)品特點(diǎn)

1）簡(jiǎn)化了類器官活性檢測(cè)步驟：均質(zhì)的"加樣-混合-檢測(cè)"方案減少了其它同類檢測(cè)所需的操作步驟；

2）類器官用量更少：可準(zhǔn)確地檢測(cè)到低于常用的比色法和熒光法的檢測(cè)低限的細(xì)胞數(shù)。 減少了每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)所需的細(xì)胞數(shù)；

3）迅速獲得結(jié)果：加入試劑后10min就能獲得數(shù)據(jù)；

4）可自行選擇檢測(cè)方案：可用于多種類型的多孔板操作?？捎冒l(fā)光檢測(cè)儀或CCD成像設(shè)備記錄數(shù)據(jù)；

5）可連續(xù)處理培養(yǎng)板：發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定，樣品可進(jìn)行批量處理。

使用方法

1、類器官的準(zhǔn)備：

使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的96孔板（底和蓋子透明，孔壁不透，推薦貨號(hào)：abs7242），每孔接種5uL-10uL類器官基質(zhì)膠混懸物，放培養(yǎng)箱半小時(shí)以上，待凝固后加入100uL類器官培養(yǎng)基（如使用384孔板，每孔接種2.5μL-4μL類器官基質(zhì)膠混懸物，具體用量視不同類型的384孔板而定），并確保檢測(cè)時(shí)每孔的細(xì)胞數(shù)量在5萬個(gè)以內(nèi)（如使用384孔板宜控制在1萬個(gè)以內(nèi)），同時(shí)設(shè)置不含類器官的基質(zhì)膠培養(yǎng)液孔作為陰性對(duì)照，按照類器官培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)類器官。如有需要，可加入藥物處理類器官。此外，如有必要，也可以設(shè)置類器官的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。

2、試劑準(zhǔn)備：

1管凍干粉加入1管10mL buffer里，混勻避光待用。

注：溶解后盡快使用，-80℃，避光保存，有效期一個(gè)月。

1）溶解Organoid ATP發(fā)光法檢測(cè)試劑，如有必要可適當(dāng)分裝該試劑；

2）按照96孔板每孔100μL（384孔板每孔25μL）的量，取適量Organoid ATP發(fā)光法檢測(cè)試劑，平衡至室溫。

3、類器官活力檢測(cè)：

1）取出類器官培養(yǎng)板在室溫平衡10min（通常不宜超過30min）；

2）將96孔板每孔里的類器官培養(yǎng)基去除，每孔加入100μL Organoid ATP發(fā)光法檢測(cè)試劑（384孔板每孔25μL）； 注：無需去除基質(zhì)膠。

3）室溫劇烈振蕩（微孔板恒溫振蕩器，推薦貨號(hào)：abs72034）5min使類器官充分裂解；

4）室溫（約25℃）孵育10min，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定；

5）使用具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。請(qǐng)根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間一般為0.25- 1s或更長(zhǎng)時(shí)間，具體需根據(jù)儀器的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；

6）根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計(jì)算類器官的相對(duì)活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ATP的量從而計(jì)算出類器官的相對(duì)活力。

注：檢測(cè)效果因類器官的種類不同而有所不同，對(duì)于一些ATP含量特別高的類器官，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到50,000個(gè)后可能會(huì)不呈線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會(huì)繼續(xù)升高。

常見問題

1、熒光素酶的活性對(duì)溫度比較敏感，所以反應(yīng)前類器官和檢測(cè)試劑均需平衡至室溫后再進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)試劑請(qǐng)混勻后使用；

2、本試劑盒的檢測(cè)試劑中含有熒光素酶，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致其逐漸失活。為取得良好的使用效果，第一次溶解后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染；

3、待測(cè)藥物的溶劑含量較高時(shí)可能會(huì)干擾熒光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號(hào)?？梢酝ㄟ^設(shè)置含有溶劑的類器官培養(yǎng)液對(duì)照孔排除溶劑的干擾；

4、檢測(cè)時(shí)須使用適合于類器官培養(yǎng)的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會(huì)產(chǎn)生相互干擾；

5、類器官接種密度，以24傳96孔板為例。

傳代前狀態(tài)：24孔板，每孔25uL基質(zhì)膠類器官凝聚物，500uL培養(yǎng)液

傳代比例：類器官1:2傳代

接種方式：24孔板傳96孔板

96孔接種要求：每孔5uL基質(zhì)膠類器官凝聚物，100uL培養(yǎng)液

接種孔數(shù)：24孔板收集3孔類器官傳代，按1:2傳代比例要傳6孔，每孔點(diǎn)膠25uL，總點(diǎn)膠量6*25=150uL，此時(shí)傳于96孔板，每孔點(diǎn)膠量5uL，總點(diǎn)孔數(shù)150/5=30孔

圖 ICC（膽管癌）類器官96孔鋪板密度圖

檢測(cè)案例

1、類器官藥敏-人肝膽管癌(ICC)

結(jié)論：人肝膽管癌(ICC)類器官對(duì)Oxaliplatin、Lenvatinib、Larotrectinib、Regorafenib不敏感；對(duì)Cisplatin、Paclitaxel敏感

2、類器官藥敏-人肺癌

結(jié)論：人肺癌類器官對(duì)drug1一般敏感； 對(duì)drug2敏感

3、類器官藥敏-人胰腺癌

結(jié)論：人胰腺癌類器官對(duì)Irinotecan、Oxaliplatin一般敏感；對(duì)Paclitaxel、Gemcitabine敏感；兩個(gè)病人表現(xiàn)出的藥敏效果一致。

4、類器官藥敏-人胰腺癌

結(jié)論：人胰腺癌類器官對(duì)Larotrectinib、Oclacitinib、Lenvatinib、5-Fluorouracil不敏感一般敏感；兩個(gè)病人表現(xiàn)出的藥敏效果一致。

今天講解就到這了，大家如有類器官活力檢測(cè)問題，歡迎入群交流哦！

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