環(huán)狀(circRNA)是一類(lèi)特殊的共價(jià)閉環(huán)RNA分子，在調(diào)控生理和病理進(jìn)程中，通過(guò)不同的機(jī)理發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)上，circRNA被認(rèn)為是一種非編碼RNA(ncRNA)。2014年，在北卡羅來(lái)納大學(xué)報(bào)導(dǎo)了環(huán)形RNA在細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)非帽依賴(lài)的機(jī)理來(lái)翻譯蛋白，人們認(rèn)識(shí)到circRNA也具有編碼與表達(dá)蛋白的能力。此后，隨著體外環(huán)化技術(shù)的發(fā)展，比線(xiàn)性mRNA穩(wěn)定性更強(qiáng)的合成circRNA成為mRNA治療領(lǐng)域備受關(guān)注的新技術(shù)，有望以mRNA藥物相似的遞送方法，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。

圖1 環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)

一、circRNA的特點(diǎn)

1、強(qiáng)穩(wěn)定性：與線(xiàn)性RNA相比，circRNA的主要優(yōu)勢(shì)就是其環(huán)狀結(jié)構(gòu)提高了穩(wěn)定性。因?yàn)閏ircRNA中5’和3’末端的缺失使其具有外切酶抗性，不能通過(guò)典型的RNA降解途徑降解，需要通過(guò)核酸內(nèi)切酶線(xiàn)性化后將其降解（圖2，a-c），因此，具有更高的體內(nèi)穩(wěn)定性，半衰期更長(zhǎng)。

圖2 circRNA的降解和翻譯

2、非帽依賴(lài)性翻譯：大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯起始于5’端，以典型的帽(7GpppN)依賴(lài)方式進(jìn)行（圖2，d），由于步驟復(fù)雜且需要招募較多起始因子，該過(guò)程具有高能量消耗的特點(diǎn)，因此，當(dāng)機(jī)體處于病毒感染或疾病等細(xì)胞應(yīng)激的不利條件下，該典型翻譯起始將被整體抑制，以確保細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)激并存活。那么當(dāng)?shù)湫头g機(jī)制下調(diào)時(shí)，維持細(xì)胞生存所需要的關(guān)鍵蛋白的產(chǎn)生就需要另一套非典型翻譯機(jī)制，即非帽依賴(lài)性翻譯—通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)來(lái)驅(qū)動(dòng)，而這種非帽機(jī)制正適合無(wú)5’端的circRNA，已知IRES是circRNA主要的翻譯方式。換言之，在疾病治療過(guò)程中，當(dāng)機(jī)體處于ER應(yīng)激、遺傳毒性應(yīng)激、缺氧、營(yíng)養(yǎng)剝奪、體溫過(guò)低、體溫過(guò)高或感染狀態(tài)下，帽依賴(lài)性翻譯起始被抑制，線(xiàn)性mRNA無(wú)法有效翻譯，基于mRNA的藥物療效降低，而circRNA可憑借非帽依賴(lài)性翻譯的機(jī)制優(yōu)勢(shì)，保證蛋白質(zhì)的正常翻譯，保證藥物療效。

3、多順?lè)醋颖磉_(dá)：多順?lè)醋颖磉_(dá)是指從單個(gè)mRNA分子中翻譯兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的基因。對(duì)于多順?lè)醋泳€(xiàn)性mRNA，5’cap比IRES的表達(dá)更高，導(dǎo)致蛋白表達(dá)比例不均。而對(duì)于circRNA，通過(guò)引入多個(gè)IRES-ORF，有可能達(dá)到接近化學(xué)計(jì)量的多順?lè)醋颖磉_(dá)，因?yàn)樗芯幋a的蛋白質(zhì)都具有相同的翻譯起始機(jī)制。雖然這一點(diǎn)尚未得到證實(shí)，但circRNA的多順?lè)醋颖磉_(dá)可能有益于多組分蛋白質(zhì)療法，其中蛋白質(zhì)復(fù)合物組分的受控比例至關(guān)重要。

4、免疫原性低：線(xiàn)性RNA通過(guò)病原體識(shí)別受體（如RIG-I、TLR3、TLR7、TLR8等）刺激先天免疫，導(dǎo)致干擾素反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)其翻譯及應(yīng)用造成了負(fù)面影響；而純的circRNA并不存在RIG-I、TLR3、 TLR7及TLR8的識(shí)別序列，這種“免疫沉默(immunosilent)"可以使其更有效地表達(dá)蛋白質(zhì)，而沒(méi)有抑制性干擾素反應(yīng)。此外，先天免疫系統(tǒng)激活減少限制了樹(shù)突狀細(xì)胞的活化和成熟，有助于防止對(duì)編碼的治療蛋白產(chǎn)生免疫力。

二、circRNA的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)替代療法

蛋白質(zhì)替代療法的目的是恢復(fù)那些缺失或有缺陷的蛋白質(zhì)功能，通常是由基因突變導(dǎo)致。采用mRNA治療內(nèi)源蛋白缺失已應(yīng)用于多種疾病

相對(duì)于mRNA，circRNA在蛋白替代療法的應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢(shì)，如結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)；具有與線(xiàn)性RNA相似的蛋白表達(dá)峰值，但下降率較低。這些優(yōu)勢(shì)使得circRNA可以產(chǎn)生較高的蛋白質(zhì)累積并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間；減少給藥頻率，且免疫原性較低。

2、疫苗

mRNA疫苗具有高效、研發(fā)周期短、模塊化生產(chǎn)、低成本等優(yōu)勢(shì)，已是通用的疫苗種類(lèi)，尤其在應(yīng)對(duì)新冠等突發(fā)流行病，其極快的研發(fā)制造能力，優(yōu)勢(shì)極為顯著。同時(shí)，在面對(duì)病毒變異方面，多價(jià)mRNA疫苗的易得性可及時(shí)提供針對(duì)多種病原體的保護(hù)，意義重大。

另外，mRNA疫苗的自佐劑效應(yīng)也為疫苗保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)提供了支持。在機(jī)制上，mRNA會(huì)引起與病毒免疫相關(guān)的Th1偏向免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)增和免疫記憶形成至關(guān)重要的I型干擾素反應(yīng)，對(duì)病毒預(yù)防極有幫助。不過(guò)該機(jī)制同時(shí)也限制了mRNA的帽依賴(lài)性翻譯起始，影響表達(dá)效率。那么circRNA所使用的非帽依賴(lài)性起始機(jī)制，例如不受干擾素抑制的IRES，是一種有吸引力的替代方案。在保持circRNA抗原表達(dá)穩(wěn)定的同時(shí)，更有效地誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的保護(hù)作用。

疫苗接種的目標(biāo)是誘導(dǎo)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和長(zhǎng)期免疫記憶。適應(yīng)性免疫記憶的誘導(dǎo)部分取決于抗原暴露的持續(xù)時(shí)間。因此，RNA編碼抗原的長(zhǎng)期表達(dá)可以更有效地引發(fā)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng) 。與mRNA相比，circRNA固有的穩(wěn)定性延長(zhǎng)了蛋白質(zhì)翻譯的時(shí)間，增加了體內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，長(zhǎng)期表達(dá)抗原可以更有效地誘導(dǎo)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng)。

3、癌癥免疫療法

癌癥免疫治療采用機(jī)體免疫的作用成分如細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞等進(jìn)行癌癥的治療?；赗NA的免疫治療可以通過(guò)將癌癥新抗原編碼為疫苗、免疫刺激細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞受體實(shí)現(xiàn)，具有靈活性及多功能性。此外，還可以通過(guò)非病毒載體以mRNA直接轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，在體原位生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞，避免了傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞制造的缺點(diǎn)。

circRNA在癌癥免疫治療中有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：

1）與mRNA相同，circRNA既可應(yīng)用于腫瘤個(gè)性化治療，也可同時(shí)編碼多種新抗原，降低癌癥逃逸和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于精準(zhǔn)細(xì)胞治療，可以通過(guò)改變編碼序列輕松定制嵌合抗原受體的circRNA編碼，并定制以靶向不同類(lèi)型的癌癥進(jìn)行精準(zhǔn)癌癥免疫治療；

2）circRNA的穩(wěn)定性強(qiáng)，可以保證抗原蛋白的穩(wěn)定表達(dá)；circRNA癌癥疫苗可以延長(zhǎng)抗原呈遞，獲得更強(qiáng)的免疫反應(yīng)；增加免疫刺激蛋白，如細(xì)胞因子和小抗體片段的表達(dá)時(shí)間，可以更好地將免疫細(xì)胞招募到腫瘤部位；

3）早期研究表明，修飾mRNA的低免疫原性對(duì)腫瘤中的蛋白質(zhì)表達(dá)很重要，因此circRNA固有的較低免疫原性對(duì)于腫瘤內(nèi)免疫刺激蛋白表達(dá)更具優(yōu)勢(shì)。未修飾的RNA激活先天免疫系統(tǒng)將降低抗體表達(dá)，阻止適應(yīng)性免疫細(xì)胞有效募集到腫瘤中；

4）由于IRES啟動(dòng)的非帽依賴(lài)性翻譯既可適應(yīng)各種復(fù)雜的腫瘤環(huán)境，也可抵抗癌細(xì)胞減緩蛋白翻譯并逃逸細(xì)胞因子或抗體免疫治療機(jī)制，增加了不同癌癥治療的一致性。

4、基因編輯

在基因編輯方面，基于circRNA的穩(wěn)定性，首先可應(yīng)用于小的RNA組分，比如向?qū)NA(adRNA/gRNA)，因?yàn)樵诨蚓庉嬒到y(tǒng)中的向?qū)NA是最脆弱的，很容易被核酸酶降解；其次，circRNA也有望用于編碼基于蛋白質(zhì)的編輯器以進(jìn)行基因編輯。與mRNA相比，circRNA提供的穩(wěn)定性和穩(wěn)健表達(dá)可以使Cas9蛋白的持久性更長(zhǎng)，增加的蛋白表達(dá)可能會(huì)顯著提高基因編輯效率。

在ADARs介導(dǎo)的RNA編輯中，2019年，北京大學(xué)魏文勝課題組曾研發(fā)出了借助gRNA募集ADAR實(shí)現(xiàn)RNA精準(zhǔn)編輯的新策略^[1]：LEAPER™。LEAPER™通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)短工程化的ADAR募集RNA(ADAR-recruiting RNA，arRNA)來(lái)完成ADAR的招募以及RNA編輯，由于這種技術(shù)彼時(shí)尚不成熟，具有一定長(zhǎng)度的arRNA可能引起鄰近的堿基的脫靶編輯。2022年，魏文勝課題組推出了LEAPER™的升級(jí)版本—— LEAPER™ 2.0，設(shè)計(jì)并運(yùn)用了可招募ADAR的環(huán)形RNA(circular ARAR-recruiting RNA，circ-arRNA)^[2]，通過(guò)AAV遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細(xì)胞和類(lèi)器官中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程的RNA編輯，這種可避免核酸外切酶切割的環(huán)狀RNA進(jìn)一步提升了體外和體內(nèi)編輯的效率和精準(zhǔn)性，基本清除了雙鏈RNA區(qū)域內(nèi)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上的脫靶。

5、非編碼環(huán)狀RNA治療

circRNA在細(xì)胞內(nèi)具有內(nèi)源性非編碼功能，如miRNA和RNA結(jié)合蛋白海綿功能。circRNA作為調(diào)控RNA，具有作為miRNA和RNA結(jié)合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑從而進(jìn)行治療的潛力。不過(guò)目前已有研究都處于體外實(shí)驗(yàn)階段，尚未有體內(nèi)數(shù)據(jù)，不過(guò)受限于遞送問(wèn)題，體內(nèi)模型可能也難以實(shí)現(xiàn)。

circRNA是共價(jià)封閉的、高度穩(wěn)定的RNA形式，具有巨大的治療應(yīng)用潛力。與線(xiàn)性蛋白相比，circRNA具有穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)的能力等優(yōu)點(diǎn)，在疫苗開(kāi)發(fā)、癌癥免疫治療、蛋白質(zhì)替代治療和基因編輯方面有著廣闊的可應(yīng)用空間?？傊甤ircRNA在基于RNA的藥物領(lǐng)域是一種有潛力的RNA形式，有望更新個(gè)性化治療手段。

[1]Yi, Z., Zhu, S., et al. (2019). Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature biotechnology, 37(9), 1059–1069. 

[2] Yi, Z., Qu, L., Tang, H. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022). 

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