● 什么是蛋白磷酸化？

蛋白磷酸化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)，指的是在蛋白質的特定氨基酸殘基上添加磷酸基團的過程。這一過程通常由一類稱為蛋白激酶的酶催化，而去除磷酸基團則由磷酸酶催化。磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸(Serine)、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)殘基上。

圖1 蛋白磷酸化示意圖

● 常見的蛋白激酶

國際生物化學聯(lián)合會根據(jù)受體氨基酸的特異性，將蛋白激酶分為以下幾類：

1）以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶；

2）以苯基為磷酸受體的磷酸轉移酶稱為蛋白酪氨酸激酶；

3）以His，Arg或Lys為受體的磷酸轉移酶稱蛋白His激酶；

4）以Cys殘基作為受體的磷酸轉移酶稱蛋白Cys激酶；

5）以乙?；鳛槭荏w的磷酸轉移酶稱天冬或谷氨酰胺激酶。

前兩類酶最常見，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。

● 研究蛋白磷酸化的意義？

1）細胞信號傳導和調控：蛋白磷酸化在細胞內的信號傳導中起著關鍵作用。通過磷酸化修飾，蛋白質能夠被激活或抑制，從而參與細胞內多種信號通路的調控，包括細胞增殖、凋亡、分化等。這種修飾方式在細胞信號傳導、基因表達調控、細胞周期調控等生物學過程中發(fā)揮著重要作用；

2）細胞周期和增殖：蛋白質磷酸化在細胞周期的各個階段中發(fā)揮重要作用。磷酸化修飾可以調控細胞周期蛋白的活性，控制細胞的有序分裂和增殖，維持細胞的正常功能；

3）疾病發(fā)生和治療：許多疾病的發(fā)生與蛋白質磷酸化的異常有關。研究蛋白質磷酸化的變化可以幫助我們理解疾病的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點，并開發(fā)新的藥物治療策略。異常的蛋白磷酸化與許多疾病有關，特別是癌癥。例如，某些致癌基因編碼的蛋白激酶可能會導致不適當?shù)牧姿峄?，進而促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展；

4）藥物開發(fā)與篩選：通過分析蛋白質磷酸化的變化，可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點和信號通路，指導藥物的設計和開發(fā)。同時，蛋白質磷酸化分析還可以用于藥物篩選，評估藥物對特定磷酸化位點的調控效果；

5）個體化醫(yī)學：蛋白質磷酸化分析可以為個體化醫(yī)學提供重要的指導。通過檢測磷酸化位點的狀態(tài)，可以預測患者對特定治療的響應，為臨床治療決策提供依據(jù)；

6）生物標志物鑒定：研究人員通過分析蛋白質磷酸化的變化，發(fā)現(xiàn)了許多與疾病相關的生物標志物。這些生物標志物可以用于疾病早期診斷、預后評估和治療監(jiān)測等；

7）蛋白質功能和穩(wěn)定性：磷酸化作用可以改變蛋白質的構象，從而改變其活性和/或穩(wěn)定性。例如，磷酸化可以通過改變酶的活性狀態(tài)來調節(jié)酶的活性。另外，磷酸化還可以通過改變蛋白質的降解速率來調控蛋白質的穩(wěn)定性；

8）蛋白質相互作用：磷酸化可以改變蛋白質或蛋白質與其他蛋白質之間的相互作用。例如，磷酸化可以介導蛋白質與配體的結合，從而影響信號轉導通路的激活。此外，磷酸化還可以改變蛋白質與其他蛋白質之間的親和力或抗體性，從而影響細胞中的復雜網(wǎng)絡互作。

● 常用的蛋白質磷酸化檢測方法有哪些？

免疫印跡(Western Blotting)：這是一種常用的蛋白質檢測技術，可用于檢測蛋白質磷酸化水平。關鍵步驟包括蛋白質提取、蛋白質分離和轉移、抗體識別和信號檢測。通過選擇特異性的磷酸化抗體，可以準確檢測目標蛋白的磷酸化水平。

質譜分析法(Mass Spectrometry)：質譜分析是一種高靈敏度和高分辨率的蛋白質分析技術，可用于檢測蛋白質磷酸化位點和定量磷酸化水平。常用的方法包括液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS/MS)和磷酸化肽富集等。通過分析質譜數(shù)據(jù)，可以鑒定和定量磷酸化肽，并確定磷酸化位點。

酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)：可以利用磷酸化特異性抗體對蛋白質樣本中的磷酸化水平進行定量分析。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體，和磷酸化狀態(tài)無關。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。

放射性同位素標記法：通過使用32P同位素放射性標記磷酸鹽作為磷酸基團供體，經過磷酸化酶促反應，帶有32P同位素放射性標記的磷酸基團則轉移到相應的反應蛋白上，通過凝膠電泳分離，可以用放射自顯影或磷儲屏檢測磷酸化蛋白質。

免疫熒光和流式細胞術等也是蛋白質磷酸化研究的工具。除此以外，今天給大家介紹蛋白質磷酸化檢測的新技術——Phos-iso SDS-PAGE

● 什么是Phos-iso SDS-PAGE？

這是一種磷酸親和電泳技術，可使用常規(guī)SDS-PAGE程序分離磷酸化和非磷酸化蛋白質。該技術的核心成分Phos-iso Acrylamide是一種能與磷酸基團特異性結合的雙核金屬絡合物，能夠對磷酸化蛋白進行分離和檢測。使用過程 中只需在常規(guī)SDS-PAGE凝膠中添加Phos-iso Acrylamide和金屬離子（Mn2+或Zn2+）即可。在電泳時，固定在凝膠上的Phos-iso復合物可以特異性結合磷酸化蛋白，使得磷酸化蛋白電泳遷移率降低，從而實現(xiàn)磷酸化和非磷酸化蛋白的分離。Phos-iso SDS-PAGE操作簡單，能檢測不同形式的磷酸化蛋白，不受磷酸化抗體限制，可用于免疫印跡、質譜分析等。

圖2 Phos-iso Acrylamide與常規(guī)SDS-PAGE的對比示意圖

● Phos-iso SDS-PAGE技術優(yōu)勢

1）不需要準備針對磷酸化蛋白的抗體，用總抗體而非抗磷酸化蛋白的抗體即可同時檢測磷酸化和非磷酸化的蛋白；

2）可適用于免疫印跡和質譜分析等后續(xù)操作；

3）磷酸化位點具有不同數(shù)目和位置的磷酸化形式也可以分離。

● 愛必信新品速遞——Glass gel 磷酸化蛋白預制膠

Glass gel磷酸化蛋白預制膠（搭配abs9941磷酸化蛋白上樣緩沖液(3×)），預先加入了100μmol/L的Phos-iso Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結果也很整齊。分離后，膠可用于考馬斯亮藍染色，免疫印跡和質譜實驗。

1）采用自動化的灌膠生產技術，確保了產品質量的高穩(wěn)定性和重復性；

2）采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附，使蛋白條帶更為敏銳，清晰；

3）膠夾打開極為輕松，只需用刀片在膠夾一側輕輕劃一下即可打開；

4）兼容市場上主流的mini電泳槽，如Bio-Rad、Invitrogen、天能和君意東方等。

圖3 磷酸化蛋白電泳實例圖

● 常見問題解答

1、條帶彎曲

1）樣品中含無機鹽、表面活性劑、EDTA和釩酸等（可使用TCA沉淀或透析脫鹽等處理樣品）；

2）樣品處理不當，如樣品呈粘性酸性等（變性充分，酸性樣品溶液呈現(xiàn)黃色-橙色，加入Tris緩沖液中和至藍紫色即可）；

3）預染Marker條帶因含有螯合劑等彎曲導致相鄰條帶彎曲，空白泳道也會導致條帶彎曲（樣品與Marker之間使用上樣緩沖液間隔）；

4）電泳溫度高。

2、無法辨別磷酸化條帶

 進行常規(guī)SDS-PAGE，驗證沒有發(fā)生條帶遷移。

3、如果有對應的磷酸化抗體，磷酸化抗體與Phos-iso SDS-PAGE如何選擇？

如果使用磷酸化抗體，需要壓完磷酸化抗體后，將抗體從膜上剝離(strip)后再壓一次總蛋白抗體。如果使用Phos-iso SDS-PAGE，就能在同一塊膜上標記出磷酸化（或幾種不同磷酸化形式）與非磷酸化的條帶，并可以根據(jù)條帶灰度比較兩者的量。

4、樣品必須是純化的蛋白嗎？

不一定，細胞裂解液也可以。純化的樣品進行Phos-iso SDS-PAGE即可進行檢測。細胞裂解液，則需要進行Western Blotting。

● 注意事項

1）請勿置于0℃以下。凝膠在0℃以下會凍凝，產生氣泡和裂紋，導致凝膠報廢；

2）需要進行樣品前處理，并且樣品品質很大程度影響電泳效果；

3）電泳速度會變慢；

4）無法通過分子量marker推斷分子量；

5）轉膜需要EDTA處理；

6）普通SDS-PAGE也同時進行；

7）磷酸化蛋白預制膠SDS-PAGE對于蛋白樣品中的雜質非常敏感，尤其是螯合劑、釩酸、無機、表面活性劑這類物質。強烈建議在磷酸化蛋白預制膠SDS-PAGE之前通過TCA沉淀或滲析法降低雜質含量；

8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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