活性氧（ROS）是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫、羥基自由基等。它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，但過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并與多種疾病有關(guān)。目前針對(duì)ROS的檢測(cè)方法包括熒光染色法、化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振技術(shù)（EPR/ESR）、電化學(xué)生物傳感器、色譜法、分光光度法和基于熒光蛋白的方法（表1）。

表1 常用ROS的檢測(cè)方法

檢測(cè)ROS水平對(duì)于理解細(xì)胞生理功能和環(huán)境因素導(dǎo)致的細(xì)胞損傷至關(guān)重要。今天小愛(ài)帶大家重點(diǎn)了解熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的原理及具體操作步驟。

活性氧檢測(cè)攻略

一、選擇合適的探針

DCFH-DA：這是一種常用的熒光探針，通過(guò)檢測(cè)其氧化產(chǎn)物DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身無(wú)熒光，可自由穿過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解生成DCFH，隨后被氧化生成DCF，其熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。

圖1 DCFH-DA探針在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制^[1]

二、 實(shí)驗(yàn)步驟（以abs580232，活性氧ROS檢測(cè)試劑盒為例）

1、裝載ROS探針

1）原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于5×10⁵/mL。

② 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型決定。

③（可選）陽(yáng)性對(duì)照：先用無(wú)血清培養(yǎng)基等稀釋陽(yáng)性對(duì)照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30min-4h，以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類(lèi)型存在差異。例如：HeLa細(xì)胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90min。

④ ROS探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

⑤ ROS探針裝載：吸除處理藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積需充分蓋住細(xì)胞。例如：6孔板通常不少于1mL，對(duì)于96孔板通常不少于100μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30min。

⑥ 細(xì)胞清洗：用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2）收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)用細(xì)胞狀態(tài)。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

② 藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型決定。

③（可選）陽(yáng)性對(duì)照：先用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30min-4h以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類(lèi)型存在差異。例如：HeLa細(xì)胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90min。

④ ROS探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

⑤ 探針裝載：除去細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1.0×10⁶-2.0×10⁷。注意：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)體系，檢測(cè)方法，以及檢測(cè)總量來(lái)進(jìn)行調(diào)整。例如：對(duì)于流式分析，單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于10⁴，也不可多于10⁶。

⑥ 細(xì)胞清洗：用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2、熒光顯微鏡檢測(cè)

1）對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取25-50μL 細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

2）熒光顯微鏡下，選用FITC濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3、流式細(xì)胞儀分析

1）對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。用0.5-1mL PBS重懸細(xì)胞(0.5-1×10⁵/mL)。

2）選擇流式細(xì)胞儀FL1或BL1通道，488nm激發(fā)，測(cè)定530nm的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光。

DCFH-DA在ROS檢測(cè)中的應(yīng)用

Gao^[2]等采用標(biāo)準(zhǔn)熒光探針 2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸（abs42197174，DCFH-DA）來(lái)測(cè)定脂質(zhì)體處理后4T1細(xì)胞內(nèi)的ROS。具體操作流程如下：

1）將4T1細(xì)胞接種在35mm培養(yǎng)皿中，密度為8×10⁴細(xì)胞/孔。

2）細(xì)胞培養(yǎng)24h匯合度達(dá)到70–80%后，將脂質(zhì)體（1mL，1mg/mL）加入培養(yǎng)基中。配方處理6h后，用PBS洗滌細(xì)胞三次。

3）用DCFH-DA（abs42197174，10μM）染色，孵育30min后，用PBS洗滌細(xì)胞三次，然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行CLSM成像。

圖2 4T1細(xì)胞中的ROS成像^[2]

無(wú)論脂質(zhì)體類(lèi)型如何，巖藻糖工程化脂質(zhì)體在4T1細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS都比非靶向脂質(zhì)體多（圖2），主要是因?yàn)榧?xì)胞攝取增強(qiáng)。由于DAPC過(guò)氧化，DAPC-Fuc在ROS生成方面比DOPC-Fuc更有效。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio Protoc. 2017;7(17):e2545.

[2] Gao Z, Zhang J, Hou Y, et al. Boosting the synergism between cancer ferroptosis and immunotherapy via targeted stimuli-responsive liposomes[J]. Biomaterials.2024;305:122442.

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