在生命的宏偉藍(lán)圖中，干細(xì)胞扮演著“萬能建筑師"的角色，它們具有自我更新和分化成多種類型細(xì)胞的能力。而人多能干細(xì)胞，作為干細(xì)胞家族中比較出色的，更是蘊含著無限可能，能夠分化為人體幾乎所有的細(xì)胞類型，包括神經(jīng)細(xì)胞。這一特性，讓科學(xué)家們看到了治療因神經(jīng)元損失或損傷導(dǎo)致的疾?。ㄈ缗两鹕?、阿爾茨海默病、脊髓損傷等）的曙光。然而，要實現(xiàn)這一目標(biāo)，關(guān)鍵在于找到一種高效、穩(wěn)定且安全的方法，引導(dǎo)人多能干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，進(jìn)而發(fā)育成具有特定功能的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。正是基于這一需求，神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)運而生，它如同一座精心設(shè)計的橋梁，連接著希望與挑戰(zhàn)，帶領(lǐng)我們邁向神經(jīng)再生的新紀(jì)元。

下面，小愛給大家分三大塊介紹由人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化方法，人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。

人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

一、實驗準(zhǔn)備：

1、人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制

（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲存于-20~-80℃，避免反復(fù)凍融；

（2）按1:50的比例將hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403)。

注意：混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用配制已超過3周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。

（3）實驗試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要37℃水浴加熱。

二、操作方法（以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作）

hPSC 細(xì)胞復(fù)蘇：

1、實驗操作步驟：

1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：a.一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右，對應(yīng)6孔板1孔；

b.即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將2-3mL的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1-2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8、換液：從復(fù)蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落

hPSC 細(xì)胞傳代：

2、實驗具體操作步驟：

2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2-5min；

注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3-5次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3-5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；

2.5、接種：用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過10次。

2.6、換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落染色圖

hPSC 細(xì)胞凍存：

3、實驗具體操作步驟：

3.1、清洗：同2.1；

3.2、消化：同2.2；

3.3、吹打：同2.3；

3.4、離心：同2.4；

3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細(xì)胞凍存液(abs9412)對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3-5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化方法

誘導(dǎo)培養(yǎng)基準(zhǔn)備 

1、將冷凍的PSC補充液在2°C至8°C下解凍過夜，或在37°C水浴中快速解凍約5min；

2、解凍后的補充液可分裝成多個相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制備較小體積的完整培養(yǎng)基。不要重新冷凍解凍；

3、將小瓶輕輕倒置幾次，混合解凍后的補充液；

4、從瓶中取出20mL PSC補充液，轉(zhuǎn)移到PSC培養(yǎng)基瓶中。旋轉(zhuǎn)瓶子混合，即得500mL人多功能干細(xì)胞(PSC)誘導(dǎo)神經(jīng)干培養(yǎng)基(abs9822)，簡稱誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

5、誘導(dǎo)培養(yǎng)基可在2°C至8°C保存2周。使用前，在37°C水浴中預(yù)熱當(dāng)天所需量的完整培養(yǎng)基5-10min。

PSC細(xì)胞準(zhǔn)備 

1、按照人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法—hPSC細(xì)胞復(fù)蘇步驟—1.1-1.8復(fù)蘇PSCs；

2、當(dāng)PSCs達(dá)到70-80%的融合度時，去除任何分化和部分分化的克??；

3、對PSCs進(jìn)行傳代操作，按照人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法—hPSC細(xì)胞傳代步驟—2.1-2.4傳代；

4、從新包被的6孔板中吸除包被液，并在每孔中加入2.5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

5、輕輕搖動含有誘導(dǎo)細(xì)胞懸液的離心管，將PSC以每孔2.5×10⁵ - 3×10⁵的細(xì)胞加入包被的6孔板中。例如，如果PSC懸液中的細(xì)胞團(tuán)濃度為1×10⁶個/mL，則在每孔中加入0.25-0.3mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

6、快速前后左右移動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散在培養(yǎng)皿表面，并將其輕輕置于37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中；

注意：a.傳代PSCs時，細(xì)胞應(yīng)以小團(tuán)塊的形式接種，而不是單個細(xì)胞懸液。避免將PSCs作為單個細(xì)胞進(jìn)行接種，因為這會導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加；

b.您可以在分裂時將10μM ROCK抑制劑Y27632加入PSC培養(yǎng)基中過夜，以防止細(xì)胞死亡。

神經(jīng)誘導(dǎo)

1、預(yù)熱誘導(dǎo)培養(yǎng)基至室溫；

2、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第0天（PSC傳代后約24h），PSC應(yīng)達(dá)到15-25%的融合度。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放入37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中；

3、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第2天，細(xì)胞集落的形態(tài)應(yīng)該是一致的。標(biāo)記所有非神經(jīng)分化克隆，如果有的話，用巴斯德玻璃移液管或移液管jian端去除這些不需要的克隆。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

4、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4天，細(xì)胞將達(dá)到融合。任何非神經(jīng)分化的克隆都應(yīng)標(biāo)記并移除。從每孔中抽吸廢培養(yǎng)基，每孔用5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基代替，將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

5、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第6天，細(xì)胞應(yīng)接近最大融合。去除任何非神經(jīng)分化克隆，在每個孔中加入5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

注意：在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4-7天，如果細(xì)胞的顏色變?yōu)楹稚?并且有許多漂浮細(xì)胞，說明PSCs的起始密度過高。在這種情況下，每天更換培養(yǎng)基，每孔加5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

6、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第7天，NSCs(P0)已經(jīng)準(zhǔn)備好收獲和擴增傳代。

人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

準(zhǔn)備神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基

1、NSC wan全培養(yǎng)基需要補充NSC補充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺；

2、在無菌環(huán)境中，依次將20mL NSC補充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中，此時即得神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基(abs9821)；

3、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。

注意：a.在所有成分的有效期限內(nèi)，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲存，可穩(wěn)定長達(dá)4周；

b.可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng)。

包被孔板

1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用；

2、在使用前，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，然后加入預(yù)熱的wan全NSC培養(yǎng)基。

NSC傳代

1、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90-100%的融合度時，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；

2、用5mL不含鈣和鎂的預(yù)溫DPBS洗滌細(xì)胞，然后吸棄溶液；

3、在每個培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預(yù)熱的人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保wan全覆蓋細(xì)胞；

4、用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞是否脫離。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進(jìn)細(xì)胞脫離；

5、輕輕上下移液，使團(tuán)塊分散到單個細(xì)胞懸液中；

6、加入9mL預(yù)熱好的NSC wan全培養(yǎng)基停止細(xì)胞解離反應(yīng)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；

7、200×g離心4min；

8、丟棄上清，然后用適量NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀；

9、用自動細(xì)胞計數(shù)器測定總活細(xì)胞密度；

10、從每個覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基，添加Y27632（終濃度10μM）；

11、在每個培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細(xì)胞/cm²（例如，1.25×10⁶細(xì)胞/T-25培養(yǎng)瓶），然后混合或旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸液以確保均勻分布；

12、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

注意：為了獲得最佳性能和細(xì)胞生長，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基。

NSC凍存

1、準(zhǔn)備干細(xì)胞凍存液(abs9412)；

2、按照“NSC傳代"中的步驟1至步驟7收集細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存；

3、在離心過程中，計算細(xì)胞密度為2×10⁶個活細(xì)胞/mL所需的最終體積；

注意：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液。

4、丟棄上清，然后用NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO；

6、立即將細(xì)胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）；

7、按照標(biāo)準(zhǔn)程序（每分鐘降低1°C）在自動或手動控制速率的冷凍設(shè)備中實現(xiàn)低溫保存；

8、將冷凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中。

NSC復(fù)蘇

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細(xì)胞；

2、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中；

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混合；

4、繼續(xù)添加預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基至10mL；

5、200×g離心4min，確認(rèn)細(xì)胞沉淀，丟棄上清；

6、加入5mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到包被的組織培養(yǎng)瓶中；

7、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育；

8、復(fù)蘇后24h用新鮮的預(yù)熱過的NSC wan全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

注意：為了恢復(fù)在NSC中生長的細(xì)胞，我們建議在初始傳代時以≥1×10⁵個細(xì)胞/cm²的密度接種細(xì)胞。

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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