脂質(zhì)是一類廣泛存在于生物體中的有機(jī)分子，它們?cè)诩?xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著重要角色。脂滴和膽固醇是脂質(zhì)的不同形式，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上有所不同。脂滴是中性脂的主要貯存場(chǎng)所，包括脂酰甘油和酯化膽固醇。在病理情況下，如器官發(fā)生脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)可能出現(xiàn)脂滴增多，通過脂肪染色能將這些脂滴清晰的顯現(xiàn)出來。膽固醇是真核細(xì)胞細(xì)胞膜的重要成分，能夠維持膜結(jié)構(gòu)完整性，調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在動(dòng)脈硬化、Ｃ型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

脂滴和膽固醇的染色是病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要技術(shù)，用于觀察和量化細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。目前，脂滴染色使用zui廣泛的染料包括油紅O(Oil Red O)、尼羅紅(Nile Red)、蘇丹染料(Sudan Dyes)等。膽固醇染色使用最多的染料是菲律平(Filipin III)，Filipin已被廣泛應(yīng)用30余年。它可用于標(biāo)記生物膜結(jié)構(gòu)上及非細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的自由膽固醇，也能配合應(yīng)用膽固醇酯化酶，使膽固醇酯水解成自由膽固醇而間接顯色。

接下來，小愛就給大家詳細(xì)介紹脂滴和膽固醇的染色方法。

一、脂滴染色

1、組織切片脂滴油紅O(abs42024259)染色

1）實(shí)驗(yàn)原理

油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置入染液時(shí)，染料則離開染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)（如脂滴）中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。

2）染色步驟^[1]

① 油紅O染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：稱取1g油紅O，加入100mL異內(nèi)醇配置成儲(chǔ)存液，棕色瓶4℃密封保存。

b.工作液準(zhǔn)備：使用前加雙蒸水稀釋至60%，濾紙過濾后使用。

② 用冰凍切片機(jī)切取5μm厚的肝組織切片；

③ 用95%乙醇固定，蒸餾水清洗1min，60%異丙醇浸泡30min；

④ 再用60%油紅O染色溶液處理10min和15min，蒸餾水沖洗1min；

⑤ 蘇木素復(fù)染，用自來水清洗1~3min，光鏡下觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。

3）肝組織油紅O染色結(jié)果圖：

（注：圖片來源于文獻(xiàn)[1]）

2、細(xì)胞脂滴尼羅紅(abs9114)染色（以下染色方法僅供參考）

1）實(shí)驗(yàn)原理

尼羅紅是一種親脂性熒光染色劑，它是一類環(huán)境敏感性熒光染料，能夠在富含脂質(zhì)的環(huán)境中產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，而在水性介質(zhì)中的熒光強(qiáng)度極小，這種特性使得它成為了一款極重要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的熒光指示劑，可以通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。

2）染色步驟

① 尼羅紅染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：取適量的尼羅紅（Mw：318.37g/mol）用無水DMSO充分溶解制備1mM儲(chǔ)存液，按照單次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，避光保存。

b.工作液準(zhǔn)備：用HHBS或生理緩沖液(pH 7.0)將母液按1:1000稀釋為1×尼羅紅工作液，漩渦混勻。

【注意】：

尼羅紅的實(shí)際染色濃度請(qǐng)參考文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室體系來調(diào)整。以上只做參考。

② 用檢測(cè)化合物處理細(xì)胞一段時(shí)間；

③ 離心并調(diào)整細(xì)胞濃度為1-5×10⁵cell/管；

④ 用500µL尼羅紅工作液重懸細(xì)胞；

⑤ 室溫或37oC避光孵育5-10min；

⑥ 吸掉染色工作液，用HHBS或適當(dāng)緩沖液清洗細(xì)胞；

⑦ 用500µL預(yù)熱的HHBS或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1-5×10⁵cell/管；

⑧ 熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)，Ex/Em=552/636nm。

【注意】：

① 對(duì)于貼壁細(xì)胞，可用HHBS或適當(dāng)緩沖液清洗細(xì)胞，然后直接加入尼羅紅工作液孵育；

② 細(xì)胞也可預(yù)固定，然后用尼羅紅工作液染色。

二、膽固醇染色

細(xì)胞膽固醇菲律平(Filipin III, abs42018484)染色

1）實(shí)驗(yàn)原理

菲律平的主要成分是Filipin III，它可以特異性地與游離膽固醇相互作用，而不與酯化的膽固醇結(jié)合。這種特異性結(jié)合是由于菲律平分子結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)共軛雙鍵，使其能夠與膽固醇分子的疏水部分形成復(fù)合物。當(dāng)Filipin III與游離膽固醇結(jié)合后，其激發(fā)光譜波峰約在360nm處，發(fā)射光譜波峰約在480nm處。通過檢測(cè)這些特定波長(zhǎng)附近的熒光信號(hào)，可以表征細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量。

2）染色步驟^[2]

① 菲律平染色液配制：

a.母液準(zhǔn)備：1mg菲律平粉末中加入1mL DMSO，完quan溶解配置成1mg/mL儲(chǔ)存液，按照單次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，避光保存。

b.工作液準(zhǔn)備：使用前，取適量母液加入到PBS中，稀釋成一定濃度的工作液（如0.1mg/mL）備用。

② 將細(xì)胞接種于蓋玻片中，培養(yǎng)12-18h；

③ 用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，在室溫下用4%多聚甲醛固定20min；

④ 室溫下用0.1mg/mL菲律平III處理細(xì)胞30min；

⑤ 細(xì)胞再用0.35μg/mL碘化丙啶(PI)染色5min；

⑥ 最后，用共聚焦激光掃描顯微鏡在405nm處檢測(cè)菲律平和PI染色的熒光強(qiáng)度。

3）星形膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)元細(xì)胞菲律平染色結(jié)果圖

（注：圖片來源于文獻(xiàn)[2]）

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[1] Ji X, Ma Q, Wang X, et al. Digeda-4 decoction and its disassembled prescriptions improve dyslipidemia and apoptosis by regulating AMPK/SIRT1 pathway on tyloxapol-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. J Ethnopharmacol. 2023;317:116827.

[2] Huang Y, Zhang W, Guo X, et al. Cellular cholesterol loss by DHCR24 knockdown leads to Aβ production by changing APP intracellular localization[J]. J Lipid Res. 2023;64(5):100367.

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