AD背景介紹

阿爾茨海默病(Alzheimer's  disease, AD)是一種發(fā)病原因不明、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的原發(fā)性腦部神經(jīng)性疾病，是最為常見的癡呆類型之一。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力下降、認(rèn)知功能障礙、行為異常和人格失常等。其典型的病理改變包括神經(jīng)元丟失、β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protenin, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)等^[1]。隨著人口老齡化進(jìn)程的不斷加劇，AD已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。

圖1  a)健康大腦；b)AD大腦中的大腦和神經(jīng)元的生理結(jié)構(gòu)^[2]

AD建模方法

目前常用的AD動(dòng)物模型的制備思路主要以體現(xiàn)AD病理、生理、臨床表現(xiàn)特征為導(dǎo)向，模擬AD病理特征制備模型是研究AD的重要手段。AD動(dòng)物模型的建立方法主要包括衰老模型、轉(zhuǎn)基因模型、外源性有害物質(zhì)注入模型等(表1)。例如，研究人員建立了腦內(nèi)直接注射Aβ以誘發(fā)Aβ沉積的老年斑為特點(diǎn)的AD模型。目前主要注射的Aβ為Aβ_1-42、Aβ_1-40以及Aβ_25-35，注射部位主要為單/雙側(cè)海馬CA1區(qū)或者側(cè)腦室，注射時(shí)間可從3天到數(shù)周不等^[3-4]。其中，Aβ_1-42是AD病理學(xué)研究的主要形式，它形成的核（種子）啟動(dòng)了纖維的形成，導(dǎo)致了經(jīng)典的淀粉樣變性過程。

表1 常用AD動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)比較

下面，小愛分享用Aβ 1-42誘導(dǎo)AD模型的方法^[3]。

1、Aβ_1-42的配制

(1) 取出儲(chǔ)存于-80°C條件下的人工合成Aβ_1-42凍干粉，室溫下平衡30min；

(2) 在通風(fēng)櫥內(nèi)，將 Aβ_1-42懸浮于100%HFIP(1.596g/mL)中，濃度為1mM，充分混勻后分裝成等量小份；

(3) 將分裝的等量小份用真空離心蒸發(fā)濃縮器蒸發(fā)掉HFIP，蒸發(fā)后-20°C保存；

(4) 使用前，將上述-20°C保存的小份Aβ_1-42重懸于DMSO中，濃度為5mM；

(5) 使用時(shí)，按實(shí)驗(yàn)需要用生理鹽水或者人工腦脊液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。

2、小鼠單側(cè)側(cè)腦室埋管

(1) 小鼠吸入異氟烷麻醉后，固定于小鼠腦立體定位儀上；

(2) 用75%酒精對(duì)頭部顱頂消毒，剃毛后再次消毒；

(3) 剪開頭皮，暴露顱骨，雙氧水去除顱骨表面的結(jié)締組織。顱骨干燥后，再次消毒；

(4) 利用立體定位儀將定位針指向前囟門(Bregma)并作為起始點(diǎn)，移動(dòng)定位針確定套管位置（前囟前0.46mm、顱骨中線左右各旁開1mm、深2.3mm），用顱骨鉆鉆孔，左右側(cè)腦室隨機(jī)放置套管（套管直徑0.48mm、內(nèi)芯直徑0.3mm）；

(5) 用骨膠粘合套管與顱骨之間的縫隙，骨膠干燥后用牙科水泥將套管固定在顱骨上；

(6) 將小鼠轉(zhuǎn)移至電熱毯上，蘇醒后放回飼養(yǎng)盒中，單籠單只飼養(yǎng)；

(7) 注射藥物時(shí)，拔出導(dǎo)管內(nèi)芯，用適宜長度PE管連接小鼠腦部套管和微量注射針，微量注射泵注射速度為0.5μL/min。

3、行為學(xué)任務(wù)

任務(wù)開始前對(duì)各組已完成套管埋置的小鼠注射生理鹽水或者Aβ1-42，微量注射泵注射速度為0.5μL/min，注射2μL。注射完后停針5min防止注射液倒流，然后放回內(nèi)芯，鎖緊螺帽。自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實(shí)驗(yàn)和新異位置識(shí)別任務(wù)：小鼠注射藥物10min后，開始自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實(shí)驗(yàn)和新異位置識(shí)別任務(wù)的檢測(cè)。

AD驗(yàn)證方法

理想的模型應(yīng)至少具備以下三個(gè)特征：

①具有AD的主要病理學(xué)特征：SP和NFP。

②出現(xiàn)AD的重要病理變化：神經(jīng)元死亡、神經(jīng)突觸丟失和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等。

③出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。

在AD的基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)中，小鼠模型是揭示生物學(xué)機(jī)制、驗(yàn)證分子靶點(diǎn)和篩選潛在化合物的重要資源。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠模型都可以在體內(nèi)獲得不同類型的AD樣病理。盡管有大量關(guān)于AD致病途徑的遺傳和生化研究，但作為一種以認(rèn)知障礙為主要特征的疾病，任何干預(yù)措施的最終讀數(shù)都應(yīng)該是學(xué)習(xí)和記憶的檢測(cè)^[4]。

AD小鼠模型行為分析常用的測(cè)試實(shí)驗(yàn)包括：情境恐懼條件反射、放射臂水迷宮和Morris水迷宮(圖2&3&4)。下面小愛以文獻(xiàn)^[4]為例，詳細(xì)介紹情境恐懼條件反射實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作步驟。

小鼠在一個(gè)調(diào)理室中進(jìn)行單獨(dú)測(cè)試(圖2)，該調(diào)理室位于一個(gè)帶有透明有機(jī)玻璃窗口的音效衰減箱中，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行視頻記錄。調(diào)整室有一個(gè)36bar的隔震格柵地板，地板是可拆卸的，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象之后，用75%的乙醇清洗，然后再用水清洗。為了提供背景白噪聲(72dB)，在音量衰減室的一側(cè)安裝了單個(gè)計(jì)算機(jī)風(fēng)扇。

在行為實(shí)驗(yàn)之前，每天處理一次小鼠，連續(xù)3天。試驗(yàn)室里一次只放一只動(dòng)物。將其放置在調(diào)理室中2min，然后以2800Hz和85dB的頻率發(fā)出離散音調(diào)(CS)30s。在音調(diào)的最后2s內(nèi)，鼠標(biāo)通過地板條受到腳部電擊（US，0.50-0.80mA，持續(xù)2s），可調(diào)節(jié)足部電擊的強(qiáng)度來引發(fā)更強(qiáng)的記憶。在CS/US配對(duì)之后，將小鼠在調(diào)理室中再放置30s，然后將其放回籠子中。凍結(jié)行為可以通過使用專用軟件進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通過手動(dòng)評(píng)分凍結(jié)時(shí)間進(jìn)行雙重檢查非常有用。訓(xùn)練24h后，將小鼠放回條件反應(yīng)室。凍結(jié)時(shí)間為連續(xù)5min。在訓(xùn)練后36h將小鼠更換為條件箱。通過插入一個(gè)三角形籠子來創(chuàng)造一個(gè)新的環(huán)境，籠子的地板是光滑的，帶有香草氣味。2min后（CS前測(cè)試），將小鼠暴露在與訓(xùn)練中使用的音調(diào)特征相同的音調(diào)中3min（CS測(cè)試），并測(cè)定凍結(jié)時(shí)間。通常在每種情況下使用15-20只動(dòng)物。

在測(cè)試恐懼記憶的過程中需要進(jìn)行的一個(gè)重要控制是感覺閾值評(píng)估。對(duì)電擊的感官知覺的改變可能是由于實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致對(duì)觀察到的表型記憶的錯(cuò)誤歸因。將一系列單腳電擊傳遞給放置在恐懼條件所用相同電網(wǎng)上的動(dòng)物。最初，0.1mA的電擊持續(xù)1s，評(píng)估動(dòng)物的退縮、跳躍和發(fā)聲行為。每隔30s，沖擊強(qiáng)度增加0.1-0.7mA，然后每隔30s以0.1mA的增量恢復(fù)到0mA。通過平均每只動(dòng)物對(duì)足部電擊表現(xiàn)出行為反應(yīng)的電擊強(qiáng)度，對(duì)每只動(dòng)物的發(fā)聲、退縮和跳躍閾值進(jìn)行量化。

AD的治療

據(jù)報(bào)道，目前全球阿爾茨海默病病例約為2400萬例，2050年，癡呆癥患者總數(shù)估計(jì)將增加4倍。盡管AD是一個(gè)公共衛(wèi)生問題，但到目前為止，只有兩類藥物被批準(zhǔn)用于治療AD，包括膽堿酯酶抑制劑（天然衍生、合成和雜交類似物）和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑^[5]。

AD的幾個(gè)生理過程會(huì)破壞乙酰膽堿生成細(xì)胞，減少膽堿能通過大腦的傳遞。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)分為可逆性、不可逆性和偽可逆性，通過阻斷膽堿酯酶(AChE)和丁基膽堿酯酶(BChE)分解ACh，導(dǎo)致突觸間隙中ACh水平增加而發(fā)揮作用。另一方面，NMDAR的過度激活導(dǎo)致內(nèi)流的鈣離子水平增加，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡和突觸功能障礙。NMDAR拮抗劑阻止NMDAR谷氨酸受體的過度激活，從而阻止鈣離子內(nèi)流，并恢復(fù)其正?；顒?dòng)。盡管這兩類藥物有療效，但它們只對(duì)治療阿爾茨海默病的癥狀有效，但不能治愈或預(yù)防這種疾病。

圖5 已被批準(zhǔn)用于治療AD的小分子藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

建立理想的動(dòng)物模型模擬人類疾病狀態(tài)有利于開展AD病因、發(fā)病機(jī)制及防治的深入研究。目前由于無法建立很好的AD動(dòng)物模型，所以在進(jìn)行藥物篩選時(shí)，同時(shí)用兩種或兩種以上AD動(dòng)物模型比用單一模型更有說服力，同時(shí)也可進(jìn)一步證實(shí)藥物的有效性。

[1] Puzzo D, Gulisano W,  Palmeri A, et al. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery[J]. Expert opinion on drugdiscovery, 2015, 10(7):703-711.

[2] Breijyeh Z, Karaman R. Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment [J]. Molecules, 2020, 25, (24).

[3] 呂君妍. Aβ_1-42或Aβ_1-15改善APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥小鼠記憶的機(jī)制[D]. 華東師范大學(xué), 2023.

[4] A D P, B L L, A A P,et al.Behavioral assays with mouse models of Alzheimer's disease: Practical considerations and guidelines-ScienceDirect[J]. Biochemical Pharmacology, 2014, 88( 4):450-467.

[5] Breijyeh Z, Karaman R,Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment[J]. Molecules, 2020, 25:5789

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