背景介紹

過量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激、脂肪堆積和炎癥。隨著酒精性肝病 (ALD) 在全球的流行，ALD的研究迅速增加。目前，許多研究試圖發(fā)現(xiàn)有效治療ALD的藥物，包括使用抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)腸道微生物群的藥物。

甘油三脂檢測(cè)在ALD研究中的應(yīng)用

肝脂積聚是酒精性肝病的主要病理特征之一。先前的研究表明，二甲雙胍通過抑制硬脂酰輔酶A脫飽和酶1 (SCD1) 或miR-33b的表達(dá)來抑制高糖和高胰島素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞TG蓄積。還有研究表明，二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)脂肪肝。然而，其在ALD中的作用尚不清楚。

Xie等^[1]采用一系列檢測(cè)手段探究了二甲雙胍調(diào)節(jié)酒精性肝病脂代謝的可能機(jī)制。其中甘油三酯 (TG) 檢測(cè)試劑盒(abs580085)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG的濃度，以確定二甲雙胍對(duì)ALD的影響。

甘油三酯檢測(cè)試劑盒使用方法介紹

檢測(cè)原理：

甘油三酯 (TG) ，也稱為三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和動(dòng)物脂肪中的主要成分。在人體內(nèi)，血液中甘油三酯的高水平與動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病和胰腺炎有關(guān)。試劑盒檢測(cè)原理是利用脂肪酶對(duì)甘油三酯進(jìn)行水解，產(chǎn)生甘油和游離脂肪酸。隨后通過偶聯(lián)酶促反應(yīng)在500nm下比色讀數(shù)，測(cè)定釋放甘油的量，再換算成甘油三酯的含量。

備注：

1、Enzyme：使用前加入9mL Diluent溶解；
2、Dye Reagent：使用前加入10mL Diluent溶解；
3、Assay Buffer（未提供）：例如制備100mL緩沖液，請(qǐng)將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。

操作步驟：

1、試劑和材料

1）自備試劑：Assay Buffer（例如制備100mL緩沖液，請(qǐng)將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。）
2）自備材料：酶標(biāo)儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機(jī)、計(jì)時(shí)器等。

2、樣品處理

1）細(xì)胞/細(xì)菌樣品：細(xì)胞/細(xì)菌（5×10⁶個(gè)）離心后棄上清，加入1mL緩沖液，超聲處理（功率20%，超聲處理3s，間隔10s，重復(fù)30次）后，4℃、10000g離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，置于冰上待檢測(cè)；
2）組織樣品：稱取0.1g組織，加入1mL緩沖液，冰上勻漿后，4℃、10000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于冰上待檢測(cè)；

3）血清/血漿樣品：直接置于冰上待檢測(cè)。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用蒸餾水對(duì)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品（5mmol/L）進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4、樣品預(yù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內(nèi)變化。建議多做幾個(gè)稀釋梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

5、樣品檢測(cè)

按照以下方式加樣完成后，蓋上板膠帶，混合均勻。將96孔板放入37℃的烘箱中反應(yīng)10min，隨后用酶標(biāo)儀在500nm下檢測(cè)吸光值。

6、樣品濃度計(jì)算

樣品濃度計(jì)算試劑盒說明書中提供兩種計(jì)算方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法、公式法。

針對(duì)說明書既有計(jì)算公式又有標(biāo)曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡(jiǎn)便算法。建議按照標(biāo)曲計(jì)算，雖然比較麻煩且耗費(fèi)試劑，但檢測(cè)結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。按照標(biāo)曲計(jì)算，每一次都需要重新做標(biāo)曲，因?yàn)檫@種反應(yīng)是一個(gè)變化的過程，檢測(cè)的數(shù)值會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間、溫度等產(chǎn)生變化。

圖 甘油三酯檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線示例（檢測(cè)限：0.1mmol/L-5mmol/L）

常見問題解答

Q1：我想要檢測(cè)肝臟細(xì)胞在處理后，合成甘油三酯的能力是否改變，我的理解是一方面要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯，另一方面也要檢測(cè)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的甘油三酯，那么我是不是應(yīng)該把我處理后的細(xì)胞沉淀收取，培養(yǎng)上清也一并保留，這么理解對(duì)嗎？

A1：理論上是的，既然既要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的又要檢測(cè)分泌出來的，那肯定是要一并保留上清和細(xì)胞的。

Q2：如果是將細(xì)胞上清收集后檢測(cè)，那么按照細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品的檢測(cè)方法，我的培養(yǎng)上清稀釋倍數(shù)是需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定嗎？

A2：稀釋倍數(shù)都是要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定的。

Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末狀，需要溶解，其中Dye Reagent說明書提示建議現(xiàn)用現(xiàn)配，那我如果想要做預(yù)實(shí)驗(yàn)的話，這兩種試劑溶解后，都能夠放在-80℃保存嗎？

A3：這樣操作是對(duì)的，特別是酶，溶解后在-80 ℃保存最好。需要注意的是染料不管是低溫還是高溫都會(huì)氧化，建議老師預(yù)實(shí)驗(yàn)做完盡早開展實(shí)驗(yàn)，一次性多測(cè)些樣品，防止試劑溶解后長(zhǎng)期儲(chǔ)存影響檢測(cè)效果。

Q4：TG試劑盒里面的檢測(cè)板可以拆分嗎？因?yàn)槿绻鲱A(yù)實(shí)驗(yàn)摸索稀釋倍數(shù)的話，可能只做幾個(gè)孔。

A4：板子不能拆分，但是可以用常規(guī)的96孔酶標(biāo)板替代做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

Q5：該試劑盒可以檢測(cè)組織樣本，對(duì)組織樣本的保存有什么要求嗎？

A5：沒有什么特殊要求，新鮮或者液氮速凍的組織都可以。

[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.

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