微生物制劑可加重炎癥性疾病，如多發(fā)性硬化癥(MS)，該疾病研究常用的動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)。百日咳毒素(PTX)是微生物制劑的一種，它是一種細(xì)菌毒力因子，通常被用作促進(jìn)EAE的佐劑。

需要注意的是，EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，包括小鼠的種類(lèi)和性別、百日咳毒素的劑量、佐劑的使用以及豐富的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和建模經(jīng)驗(yàn)。此外，在特定應(yīng)用中，每個(gè)批次都要確定最佳劑量。

保存和溶解方法：

保存：我司提供的百日咳毒素為無(wú)菌包裝的凍干粉，在真空下密封。重溶前后在4°C下可儲(chǔ)存6個(gè)月，避免凍融；

溶解：百日咳毒素溶于水，可用無(wú)菌水或無(wú)菌緩沖液重溶。使用前，應(yīng)輕柔搖晃，使懸液混合均勻。如果需要長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可以在高離子強(qiáng)度緩沖液中進(jìn)行重溶，如無(wú)菌0.1M磷酸鈉溶液、pH 7.0；0.5M氯化鈉溶液（注意：溶解時(shí)輕柔處理，不要進(jìn)行劇烈漩渦震蕩）。

EAE模型文獻(xiàn)分享：

在百日咳毒素作為佐劑促進(jìn)EAE模型的機(jī)制探究中，Aline Dumas等人曾報(bào)道，PTX會(huì)觸發(fā)IL-6介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)在血管內(nèi)表面爬行來(lái)增加巡邏血管的白細(xì)胞數(shù)量。隨后，Aline Dumas等人又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PTX通過(guò)其ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性誘導(dǎo)：

1）髓樣細(xì)胞中的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致促I(mǎi)L-1β合成；
2）一種依賴(lài)pyrin的炎性復(fù)合物，將促I(mǎi)L-1β裂解為其活性形式。然后，IL-1β刺激附近的基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6。

在沒(méi)有pyrin的情況下，PTX不會(huì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞與大腦毛細(xì)血管的黏附，并且在誘導(dǎo)具有腦源性T淋巴細(xì)胞小鼠的EAE方面效果較差。該研究確定了激活pyrin的第一個(gè)微生物分子PTX，感染后可能影響MS的機(jī)制，也是免疫疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

EAE誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法：

1、主動(dòng)免疫誘導(dǎo)EAE

1）小鼠兩側(cè)皮下注射200μL乳劑。乳劑中含有300μg MOG(35-55)肽（溶解于生理鹽水中），并與等量的FCA混合；

2）免疫后即刻和免疫后第2天分別給予小鼠腹腔注射PTX(20μg/kg)。

2、通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)EAE

1）給小鼠腹腔注射2×10⁷個(gè)從免疫誘導(dǎo)EAE后8天處死的小鼠腹部淋巴結(jié)和脾臟中分離的淋巴細(xì)胞；

2）然后在補(bǔ)充有MOG(35-55)肽(15μg/mL)、小鼠IL-12(5ng/mL)、小鼠IL-23(20ng/mL)，F(xiàn)BS(10%)、1%改良的Eagle培養(yǎng)基（含非必需氨基酸）、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)和兩性霉素B(250ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。

3、EAE癥狀的評(píng)估

小鼠每日體重和評(píng)分如下：

0：無(wú)疾病跡象；0.5：部分尾部癱瘓；1：尾部癱瘓；1.5：一側(cè)后肢無(wú)力；2：雙后肢無(wú)力；2.5：后肢部分癱瘓；3：后肢癱瘓；3.5：前肢部分癱瘓；4：前肢癱瘓；5：因人道原因死亡或死亡。

PTX需要Pyrin來(lái)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)爬行，并最大限度地促進(jìn)EAE。

本期小愛(ài)為大家介紹了百日咳毒素作為促進(jìn)EAE模型的佐劑，在使用過(guò)程中的注意事項(xiàng)以及文獻(xiàn)常用的造模方法。PTX具有多種生物學(xué)活性，能引起百日咳眾多的臨床癥狀，同時(shí)也是主要的免疫原。與大多數(shù)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合并特定靶向G蛋白，抑制G蛋白及其在信號(hào)通路中的生理功能。正是依賴(lài)Gi家族的蛋白偶聯(lián)受體來(lái)抑制信號(hào)通路的能力，使得PTX成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的一種重要工具。

Dumas A , Amiable N , Vaccari J P D R ,et al.The Inflammasome Pyrin Contributes to Pertussis Toxin-Induced IL-1β Synthesis, Neutrophil Intravascular Crawling and Autoimmune Encephalomyelitis[J].PLoS Pathogens, 2014, 10(5):e1004150.

免責(zé)聲明：EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，本文中提供的造模方法來(lái)源于已發(fā)表的文獻(xiàn)，僅供您參考，希望對(duì)您成功構(gòu)建模型有所幫助。

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