生物制品是指以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織作為起始材料，采用生物學工藝或分離純化技術(shù)制備，并以生物學技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、細胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品、體外免疫診斷制品等。由于其特殊的性質(zhì)，生物制品的質(zhì)量控制至關(guān)重要，國家規(guī)定應當對生物制品的生產(chǎn)過程和中間產(chǎn)品的檢驗進行特殊控制，為響應這一要求，一系列生物制品生產(chǎn)研發(fā)過程中相關(guān)雜質(zhì)的檢測試劑盒誕生，大致可分為兩大類，一類是檢測細胞來源的污染物，例如來自包裝細胞系或細菌的宿主細胞蛋白和DNA，另一類則是檢測生產(chǎn)中使用的輔助病毒、質(zhì)粒DNA、牛血清、核酸酶、蛋白酶、抗生素等物質(zhì)。

細胞來源污染物檢測

1、宿主細胞DNA/DNA片段殘留檢測

生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動物細胞株表達生產(chǎn)，雖然經(jīng)過嚴格的純化工藝，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細胞DNA，不同宿主細胞殘留的DNA帶來的潛在威脅并不相同，盡管它們有著相同的基本結(jié)構(gòu)單位，但其片段長度不同，以不同的物理形式存在，進入人體后可造成多種多樣的后果，如致癌性、感染性等。因此從安全角度，在生物制品的生產(chǎn)工藝對殘留DNA進行檢驗驗證是有必要的。

《中國藥典》、《美國藥典》和《歐洲藥典》均提及用qPCR法對DNA殘留量進行測定。TaqMan®熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光基團（報告基團），如 FAM、TET、VIC等，3’端攜帶淬滅基團，如 TAMRA、BHQ1等。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一條特異性的熒光探針，探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)（熒光定量PCR儀）可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。該方法具有特異性強、靈敏度高等特點，在目前生物制藥細胞核酸殘留檢測中被廣泛使用。

表 《中國藥典》2020版部分疫苗生物制品殘留DNA標準

2、宿主蛋白（HCP）殘留檢測

宿主蛋白即由宿主細胞產(chǎn)生的蛋白，包括目的蛋白和宿主細胞本身的蛋白，它的存在可能誘發(fā)不良免疫反應，也可能導致藥效發(fā)生變化，因此需要對原料藥和下游純化過程（DSP）中間體中的HCP進行表征和量化。多國藥典規(guī)定酶聯(lián)免疫法（ELISA）作為HCP定量方式，《中國藥典》2020版明確規(guī)定CHO細胞殘余蛋白占總蛋白含量要保持在0.05%以下。

圖 Absin CHO HCP ELISA Kit（abs590005）快速操作流程

工藝雜質(zhì)殘留檢測

1、培養(yǎng)添加劑殘留檢測

細胞培養(yǎng)是生物制品生產(chǎn)過程中經(jīng)常用到的手段，牛血清更是被廣泛使用，為細胞生長提供必須的營養(yǎng)成分，BSA則是在牛血清中大量存在，然而BSA作為外源性蛋白如果跟隨藥物產(chǎn)品進入人體，將引發(fā)嚴重的免疫反應并有可能影響藥物效果，因此《中國藥典》2020版對各種疫苗BSA的殘留量都進行了明確的規(guī)定，基本是不高于50ng/mL或者不高于50ng/劑，并且藥典也推薦了酶聯(lián)免疫吸附法用于BSA的含量測定。

除了牛血清外，各類抗生素亦是細胞培養(yǎng)過程中的添加劑，如卡那霉素、慶大霉素等，ICH（人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會）將生物制品中的殘留抗生素列為工藝相關(guān)雜質(zhì)，要求“通過研究證明其在工藝中可有效控制或去除，并達到可接受的水平"，《中國藥典》2020版明確規(guī)定對疫苗等預防類產(chǎn)品采用酶聯(lián)免疫法測定抗生素殘留，應<50ng/劑。

2、Protein A殘留檢測

Protein A有著與某些免疫球蛋白（特別是IgG）的Fc部分的高親和力，因此Protein A親和層析柱被廣泛應用于抗體類藥物的分離純化，但是在使用過程中，由于待純化物中存在蛋白水解酶，會水解Protein A，導致部分Protein A脫落并與抗體結(jié)合殘留在洗脫液中，Protein A具有免疫原性，若進入體內(nèi)可能引起不良免疫反應，因此對于殘留量需要做質(zhì)控。

3、膠原酶I型殘留檢測

膠原酶廣泛用于將組織消化成單細胞，消化得到的單細胞被用于進一步生產(chǎn)生物制品，生物制品生產(chǎn)相關(guān)法規(guī)中明確了細胞培養(yǎng)相關(guān)材料檢測的必要性，故膠原酶的殘留量檢測也愈發(fā)引起重視。

4、內(nèi)毒素檢測

內(nèi)毒素是一種脂多糖，來自革蘭氏陰性細菌的細胞壁，會在細菌死亡或自溶后被釋放，當內(nèi)毒素進入生物體，可能引起發(fā)熱反應，因此也是影響生物制品安全性的重要因素之一，《中國藥典》2020版規(guī)定用鱟試劑進行內(nèi)毒素檢測。

鱟試劑是一種從動物鱟的血液中提取的生物試劑，能夠和內(nèi)毒素發(fā)生反應，產(chǎn)生凝集沉淀，再應用凝膠法或光度測定法檢測生物制品中內(nèi)毒素的含量，為了符合可持續(xù)發(fā)展的原則，科學家們研發(fā)出了重組鱟試劑，以替代傳統(tǒng)鱟血提取物，從操作流程與分析方法上做到了無感替代。

圖 鱟與鱟試劑檢測原理

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020:1088.

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