腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境中一種可塑性異質(zhì)細(xì)胞群體，占某些實(shí)體腫瘤的50%，TAMs通常表現(xiàn)出免疫抑制M2表型，導(dǎo)致預(yù)后不良。TAMs通過(guò)刺激血管生成，增加腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制抗腫瘤免疫引起惡性發(fā)展。由于TAMs的高度可塑性，將抗炎巨噬細(xì)胞極化為促炎巨噬細(xì)胞是一種很有前途的抗腫瘤方法。目前常用的策略是通過(guò)局部或全身給藥來(lái)輸送外源性物質(zhì)，如免疫因子、單抗和免疫激動(dòng)劑。然而，在不影響正常凝血的情況下，精確誘導(dǎo)腫瘤出血的新材料仍面臨挑戰(zhàn)。

近日，南京大學(xué)吳錦慧教授團(tuán)隊(duì)在 ADVANCED MATERIALS（IF=29.4）上發(fā)表了題為“Flagella of Tumor-targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy"的研究論文。他們通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種腫瘤靶向多鞭毛細(xì)菌(flhDC VNP)，從而實(shí)現(xiàn)了精確的腫瘤出血。flhDC VNP在腫瘤中定植，并在增殖過(guò)程中過(guò)度表達(dá)鞭毛。鞭毛促進(jìn)腫瘤壞死因子TNFα 的表達(dá)，從而導(dǎo)致局部腫瘤出血。出血時(shí)滲入的紅細(xì)胞使巨噬細(xì)胞暫時(shí)極化為M1亞型。在青蒿琥酯(artesunate，Arts)存在下，其與血紅素(heme)形成一種絡(luò)合物，不斷產(chǎn)生活性氧(ROS)使暫時(shí)的極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)的極化。因此，腫瘤靶向細(xì)菌鞭毛可能為重新編程TAMs和改進(jìn)抗腫瘤治療開辟新的策略。

圖1  觸發(fā)局部出血和TAM重新編程的腫瘤靶向細(xì)菌的鞭毛示意圖

FlhDC VNP和?flhD VNP的構(gòu)建及鑒定

研究團(tuán)隊(duì)首先在減毒沙門氏菌VNP20009(Vnp)中引入高表達(dá)flhDC質(zhì)粒，構(gòu)建flhDC VNP細(xì)菌。通過(guò)阿拉伯糖(abs816776)的誘導(dǎo)，flhDC VNP成功表達(dá)由超表達(dá)質(zhì)粒編碼的熒光蛋白tdTOMATO、鞭毛和flhDC蛋白。為了研究鞭毛是否可以穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，他們連續(xù)傳代了持續(xù)表達(dá)flhDC蛋白的flhDC VNP，表明flhDC VNP的鞭毛過(guò)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。掃描電子顯微鏡觀察，表明 flhDC VNP鞭毛的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)編輯的VNP。通過(guò)敲除細(xì)菌基因組中的flhD基因構(gòu)建鞭毛缺陷沙門氏菌ΔflhD VNP，掃描電子顯微鏡觀察表明ΔflhD VNP表面無(wú)鞭毛。為了研究鞭毛的數(shù)量對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)是否是必要的，研究者進(jìn)行了瓊脂封閉式Transwell試驗(yàn)。flhDC VNP能在2 h內(nèi)迅速穿透瓊脂，而VNP和ΔflhD VNP幾乎不能穿透瓊脂。在3D細(xì)胞組織中的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，flhDC VNP穿透更深。因此，這些結(jié)果表明，他們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的flhDC VNP和ΔflhD VNP，且細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力隨著鞭毛數(shù)量的增加而增強(qiáng)。

圖2  多鞭毛細(xì)菌的構(gòu)建與表征

FlhDC VNP誘導(dǎo)腫瘤出血

為了研究鞭毛數(shù)量的增加是否會(huì)增加細(xì)菌在腫瘤中的積累，研究人員將等量的VNP，flhDC VNP和ΔflhD VNP靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間取小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果所有細(xì)菌在腫瘤中的積聚隨著時(shí)間的推移而增加。此外，在注射細(xì)菌72小時(shí)后，flhDC VNP在腫瘤中的積聚量是VNP和ΔflhD VNP的10倍。這些數(shù)據(jù)表明，鞭毛數(shù)量的增加有利于腫瘤內(nèi)細(xì)菌的增殖。在其他器官中，由于免疫細(xì)胞的清除作用，細(xì)菌的分布呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

為了探究鞭毛數(shù)量的增加是否可以增加血液中炎性細(xì)胞因子的分泌，他們比較了靜脈注射flhDC VNP、ΔflhD VNP和VNP后腫瘤壞死因子TNFα 的濃度隨時(shí)間的變化。結(jié)果表明，注射后1h血液中TNFα 濃度最高，并且flhDC VNP刺激TNFα 分泌的作用明顯高于ΔflhD VNP和VNP。由于腫瘤血管的低流速和高通透性，過(guò)量的炎癥因子可能會(huì)破壞腫瘤血管。隨著時(shí)間的推移，腫瘤出血加重，在注射細(xì)菌12h時(shí)，腫瘤內(nèi)的紅細(xì)胞浸潤(rùn)量達(dá)到最大。注射細(xì)菌后12h取材，蘇木精伊紅(H&E)染色。注射flhDC VNP的腫瘤含有最多的浸潤(rùn)性紅細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，flhDC VNP在腫瘤內(nèi)積聚，通過(guò)增加炎性細(xì)胞因子水平而導(dǎo)致腫瘤出血。

圖3  細(xì)菌誘導(dǎo)TNFα 分泌增加并且誘導(dǎo)腫瘤出血

Heme與Arts反應(yīng)形成能極化巨噬細(xì)胞的復(fù)合體

正常情況下，滲透的紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，紅細(xì)胞分解為血紅蛋白，血紅蛋白被消化為血紅素。然后，血紅素通過(guò)HRG1從內(nèi)體運(yùn)輸?shù)骄奘杉?xì)胞胞漿。血紅素能與含有過(guò)氧化鍵的抗瘧疾藥物發(fā)生特異性反應(yīng)，如Arts。當(dāng)Arts被低價(jià)過(guò)渡金屬絡(luò)合物（血紅素）激活時(shí)，弱過(guò)氧化鍵發(fā)生均質(zhì)斷裂產(chǎn)生ROS。研究人員發(fā)現(xiàn)，血紅素和Arts結(jié)合產(chǎn)生了一種具有過(guò)氧化物酶活性的復(fù)合物。過(guò)氧化物酶可以催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥基自由基，同樣也可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

ROS水平升高會(huì)影響巨噬細(xì)胞的表型。ROS通過(guò)MAPK信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、NOD樣受體和改變線粒體膜電位促進(jìn)促炎巨噬細(xì)胞極化。研究結(jié)果表明，Arts-血紅素復(fù)合體顯著增加巨噬細(xì)胞的促炎表型。促炎調(diào)節(jié)是通過(guò)改變線粒體膜電位來(lái)調(diào)節(jié)的。因此，紅細(xì)胞與Arts形成復(fù)合體，通過(guò)改變線粒體膜電位和激活NLRP3炎性小體，增加巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平，極化TAMs。

圖4  血紅素heme與青蒿琥酯Arts反應(yīng)產(chǎn)生ROS持續(xù)極化巨噬細(xì)胞

FlhDC VNP與Arts聯(lián)合應(yīng)用極化巨噬細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤炎癥微環(huán)境

由于巨噬細(xì)胞在腫瘤中的占比高達(dá)50%，并且具有高度可塑性，因此研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究flhDC VNP和Arts聯(lián)合給藥后TAMs的表型變化。結(jié)果顯示，flhDC VNP聯(lián)合Arts顯著增加了促炎TAMs的比例，降低抗炎TAMs的比例。巨噬細(xì)胞的促炎極化可能改變腫瘤的免疫微環(huán)境。對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，flhDC VNP和Arts可以上調(diào)多個(gè)炎癥相關(guān)基因以及多種炎癥信號(hào)通路、細(xì)胞趨化因子通路和免疫系統(tǒng)過(guò)程通路，如TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路。因此，flhDC VNP和Arts聯(lián)合應(yīng)用可使TAMs極化為促炎表型，增加腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而使腫瘤免疫微環(huán)境從“冷瘤"轉(zhuǎn)變?yōu)?/strong>“熱瘤"。

圖5  FlhDC VNP與Arts聯(lián)合給藥腫瘤免疫微環(huán)境表征

FlhDC VNP聯(lián)合Arts對(duì)不同腫瘤模型的抗腫瘤作用

最后，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)靜脈注射細(xì)菌結(jié)合腹膜內(nèi)注射Arts來(lái)評(píng)估flhDC VNP在CT26異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用。結(jié)果表明，當(dāng)flhDC VNP與Arts聯(lián)合作用時(shí)，Arts的抗腫瘤作用增強(qiáng)。此外，為了更好的模擬腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境，研究人員用原位結(jié)腸腫瘤模型來(lái)評(píng)估其抗腫瘤作用。結(jié)果同樣證實(shí)flhDC VNP增強(qiáng)了Arts的抗腫瘤作用。進(jìn)一步的研究表明，flhDC VNP聯(lián)合Arts對(duì)CT26移植瘤、原位CT26結(jié)腸癌和化療耐藥黑色素瘤均有一定的抗腫瘤作用，并能增強(qiáng)TCR-T細(xì)胞治療的抗腫瘤作用。

圖6   FlhDC VNP聯(lián)合Arts的抗腫瘤效果

綜上所述，腫瘤靶向細(xì)菌鞭毛可能為重新編程TAMs和重塑腫瘤免疫微環(huán)境以改進(jìn)抗腫瘤治療開辟新的策略。此研究具有廣闊的應(yīng)用前景，并獲得國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金的大力資助。

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[1] XuHH, Xiong SQ,Chen YY, et al. Flagella of Tumor-Targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-Associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy[J]. Mater. 2023, 2303357.

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