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原代培養(yǎng)

6、類器官操作流程——觀察

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傳代培養(yǎng)

一、類器官傳代培養(yǎng)——樣本收集

1、移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。

2、移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min（每 6-8 孔為一組） 。

二、類器官傳代培養(yǎng)——樣本消化

1、類器官數(shù)量不足或體積較小時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進(jìn)行第3步。

2、類器官數(shù)量較多或體積較大時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內(nèi)消化 2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6） ，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進(jìn)行第3步。（如圖4）

三、類器官傳代培養(yǎng)——鋪板

類器官收集后，添加25倍基質(zhì)膠重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如圖9）人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。

四、類器官傳代后增殖現(xiàn)象

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類器官凍存

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類器官復(fù)蘇

1、實驗前準(zhǔn)備

1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃；

2）細(xì)胞實驗室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3）在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

2、取出凍存管

1）根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

2）從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。

3、迅速解凍

迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

4、將類器官組織液移入15ml離心管，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 10ml重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min。

5、棄上清，添加1ml 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，300g 4℃ 離心 5min，棄去上清。

6、添加25倍基質(zhì)膠（abs9495）重懸（基質(zhì)膠體積：細(xì)胞沉淀體積=25:1），每孔25μl基質(zhì)膠鋪在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。

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類器官鑒定

一、類器官鑒定——類器官收集

1、類器官收集；

2、清洗1-3遍，洗去大部分基質(zhì)膠，離心棄去大部分上清。

二、類器官鑒定——瓊脂糖凹槽制備

三、類器官鑒定——固定

四、類器官鑒定——包埋

五、類器官鑒定——HE染色

六、類器官鑒定——HE染色結(jié)果（以肺癌為例）

今天講解就到這了，大家如有類器官問題，歡迎公眾號“愛必信生物"留言交流哦！

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