簡介

成型的腫瘤是一個復(fù)雜的組織，它不僅由腫瘤細胞組成，還包括也基質(zhì)細胞，炎癥細胞，脈管系統(tǒng)和細胞外基質(zhì)（ECM），所有這些總和定義為腫瘤微環(huán)境（TME），并且在腫瘤惡性進展、免疫逃逸和治療抵抗中發(fā)揮重要作用^[1]。針對腫瘤微環(huán)境的特點開發(fā)安全有效的腫瘤免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域中*前景的熱點之一^[2]。至今， 已有多項批準(zhǔn)藥物用于不同類型腫瘤的治療，在腫瘤治療方面取得了令人矚目的成就^{[2, 3]}。然而，腫瘤細胞也能夠通過多種途徑負(fù)向調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答，從而逃逸機體的免疫監(jiān)管。因此，免疫治療仍存在巨大的挑戰(zhàn)，比如治療效果和患者反應(yīng)的不可預(yù)估性，腫瘤免疫治療抵抗性，以及有效生物標(biāo)志物缺乏等等^[4]

免疫治療的陽性反應(yīng)通常依賴于腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的相互作用。在這些相互作用下，腫瘤微環(huán)境在抑制或增強免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。認(rèn)識免疫治療與TME間的相互作用不僅是剖析作用機制的關(guān)鍵，為改善目前免疫治療的療效提供新的方法也具有十分重要的意義^[5]。

多重免疫組化技術(shù)在評估腫瘤微環(huán)境中各細胞組分的表達豐度，相互作用以及空間表型信息有*的優(yōu)勢。可在同一張切片上同時對多個靶點進行標(biāo)記，幫助研究者定量評估細胞的表型和活性，全景刻畫腫瘤免疫微環(huán)境以及細胞間的原位空間信息，能讓我們更深入地了解腫瘤的發(fā)生機制，更有可能預(yù)測腫瘤對治療的反應(yīng)^[6-9]。本方案中， 我們使用了TissueGnostics公司TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析技術(shù)結(jié)合Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(abs50015)，在扁桃體腫瘤樣本中開展的多色免疫組化應(yīng)用探索。 

Panel及染料信息

*Panel及染料信息（對樣本中腫瘤細胞及不同免疫細胞表型進行多色標(biāo)記）

在石蠟包埋的甲狀腺癌組織切片上對切片進行TSA酪胺 信號方法技術(shù)，采用HRP標(biāo)記的二抗，HRP催化加入體 系的熒光素底物，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的Tyrosine共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定地共價結(jié)合熒光素。之后用熱修復(fù)洗去非共價結(jié)合的抗體，避免交叉反應(yīng)，如此往復(fù)實現(xiàn)多重?zé)晒鈽?biāo)記。

使用Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒的全新一代T S A 染色技術(shù)同時標(biāo)記 6 種生物標(biāo)志物后， 使用TissueFAXS Spectra系統(tǒng)進行連續(xù)全光譜高倍率成像， 構(gòu)建全景（多光譜）虛擬切片。獲得清晰的多色樣本圖像及各單通道獨立信號，從多靶點角度描繪復(fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境。

多色免疫熒光圖像獲取及光譜拆分

圖 1. 人甲狀腺癌組織的多重IHC 染色光譜拆分。去除背景自發(fā)熒光或血細胞/膠原等自發(fā)熒光以及去除粘液團非特異性染色的各抗體獨立真實染色圖像。使用人甲狀腺癌FFPE的七色多光譜圖像及光譜拆分結(jié)果。

組織原位蛋白細胞亞群分析

TG的細胞核識別算法在組織原位提供精準(zhǔn)的單細胞識別基礎(chǔ)，大數(shù)據(jù)的可視化正反向回溯校驗技術(shù)為其精準(zhǔn)性提供了進一步的保障。TG組織原位流式分析功能對目標(biāo)細胞進行層層篩選，可獲得雙標(biāo)、三標(biāo)乃至更 多標(biāo)的細胞的定量表達及空間定位信息，可個性化分析組織切片中任意細胞的表型特征，為細胞亞群原位可視化精準(zhǔn)分型提供強大的支撐。
圖2.利用Absin七色多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)多色標(biāo)記及TissueFAXS Cytometry 技術(shù)對樣本進行免疫細胞分型篩選及單靶點定量。圖中展示的是通過的組織流式散點圖對CD20+CD4-CD3-細胞的層層篩選識別（左圖綠色圈出），散點圖可追溯到圖像 的每一個單細胞。首先是CD20+陽性細胞群（右上圖）對此細胞群設(shè)立Cutoff線，篩選陽性細胞。并引用該陽性細胞群到下一散點圖，篩選CD4與CD3陰性細胞群（右下圖）。

圖 3.可視化正反向回溯校驗示意圖。點擊圖像中識別到的每一個指標(biāo)都可在右側(cè)散點圖中一一對應(yīng)，同時散點圖中的每個點都可精準(zhǔn)追溯到圖像中，便于我們觀察。

空間多維度定量解析腫瘤微環(huán)境

利用TissueFAXS Cytometry技術(shù)實現(xiàn)從單細胞、細胞群、組織結(jié)構(gòu)乃至器官級別的多模態(tài)，跨尺度的空間關(guān)系量化分析研究。比如可在研究腫瘤微環(huán)境方向通過空間數(shù)據(jù)挖掘延伸至腫瘤亞微環(huán)境，進一步細化對腫瘤亞微環(huán)境中多種標(biāo)記細胞與單細胞或細胞群體之間、單細胞與腫瘤組織之間、特定細胞群體與腫瘤組織之間，腫瘤組織與血管之間等復(fù)雜的相互作用關(guān)系、進而衍生出更為豐富社會學(xué)關(guān)系，挖掘以細胞社區(qū)為功能單位的科學(xué)信息，為解釋疾病的發(fā)生發(fā)展提供重要的數(shù)據(jù)來源。

圖4.以腫瘤為中心細胞群體空間分布圖。利用TissueFAXS Cytometry 技術(shù)中人工智能Classifier功能對組織樣本腫瘤與間質(zhì)區(qū)域進行特異性識別，并以腫瘤區(qū)域為中心，微米級別精度對微環(huán)境中免疫細胞的空間分布進行單細胞量化分析，不同顏色代表距離腫瘤的不同距離范圍。右側(cè)散點圖中不同顏色點數(shù)表示距離腫瘤不同距離的免疫細胞浸潤數(shù)量。

圖5.腫瘤細胞（綠色）與NK細胞（黃色）的相互作用細胞社會關(guān)系分析示意圖。通過TissueFAXS Cytometry 技術(shù)分析腫瘤細胞與NK細胞的距離關(guān)系，統(tǒng)計腫瘤細胞周圍30范圍內(nèi)的NK細胞，并以連線示意。

TissueFAXS Cytometry全景組織流式定量分析平臺

基于組織原位的精準(zhǔn)單細胞定量，強大的人工智能（AI）的特征性組織識別以及像素級的精細空間量化分析等強大的運算處理功能自由交互聯(lián)用，提供從染色到成像到數(shù)據(jù)挖掘的一站式解決方案，并可在腫瘤免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等不同的復(fù)雜微環(huán)境中實現(xiàn)精準(zhǔn)的定制化分析。

圖 6.TissueFAXS Cytometry 工作流程示意圖。

References:

1.Balkwill, F.R., M. Capasso, and T. Hagemann, The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci, 2012. 125(Pt 23): p. 5591-6.
2.Bejarano, L., M.J.C. Jordao, and J.A. Joyce, Therapeutic Targeting of the Tumor Microenvironment. Cancer Discov, 2021. 11(4): p. 933-959.
3.Galon, J. and D. Bruni, Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3): p. 197-218.
4. Hegde, P.S. and D.S. Chen, Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity, 2020. 52(1): p. 17-35.
5.Tang, H., J. Qiao, and Y.X. Fu, Immunotherapy and tumor microenvironment. Cancer Lett, 2016. 370(1): p. 85-90.
6.Tsujikawa, T., et al., Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Rep, 2017. 19(1): p. 203-217.
7.Chen, S., et al., Multiomic Analysis Reveals Comprehensive Tumor Heterogeneity and Distinct Immune Subtypes in Multifocal Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Clin Cancer Res, 2022. 28(9): p. 1896-1910.
8.Chen, X., et al., CD8(+) T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene, 2021. 40(43): p. 6223-6234.
9.Wang, T., et al., Spatial distribution and functional analysis define the action pathway of Tim-3/Tim-3 ligands in tumor development. Mol Ther, 2022. 30(3): p. 1135-1148.

愛必信（absin）提供優(yōu)質(zhì)多重應(yīng)該免疫組化試劑盒

Absin多重?zé)晒饷庖呓M化試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)單片多標(biāo)，無論是看腫瘤微環(huán)境還是看免疫浸潤，無論是進行細胞計數(shù)還是共定位分析，我們都可以實現(xiàn)，目前最高可做到六指標(biāo)七色哦~