穩(wěn)定mRNA降低免疫原性的神器—修飾核苷酸

更新時(shí)間：2022-05-06 點(diǎn)擊次數(shù)：1318

信使 RNA (mRNA) 等外源性分子介導(dǎo)的生物療法，其應(yīng)用面臨的一個(gè)主要障礙就是其免疫原性，因?yàn)轶w外合成的 mRNA 具有較高的免疫原性，可能會(huì)誘發(fā)大量炎癥反應(yīng)，不僅無(wú)法取得預(yù)期的治療效果，還會(huì)引起強(qiáng)大的副作用。關(guān)于如何降低體外合成mRNA分子的免疫原性，在過(guò)去的十幾年中，科學(xué)家們進(jìn)行了大量相關(guān)研究，其中，較為重要的發(fā)現(xiàn)之一就是多種修飾核苷酸，而含有各種修飾核苷酸的 mRNA，如假尿苷和N-6-甲基腺苷，可以有效降低mRNA的免疫原性，抑制先天免疫激活，使 mRNA可能成為再生醫(yī)學(xué)、疾病治療和細(xì)胞重編程的有力工具。

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的多種核苷酸化學(xué)修飾策略可以降低免疫原性而不影響其翻譯特性，例如將天然腺苷替換為N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）；替換天然胞嘧啶核苷為5-甲基胞嘧啶核苷（m5C）；以及將天然尿苷替換為5-甲氧基尿苷（5moU），假尿苷（ψ）或N1-甲基假尿苷（m1ψ）等。其中，m5C和ψ備受關(guān)注，因?yàn)闊o(wú)論是體內(nèi)還是體外都表明，它們?cè)谟行Ы档蚼RNA免疫原性的同時(shí)，也顯著提高了其翻譯效率。

圖1：mRNA的化學(xué)修飾匯總[1]

一、核苷酸修飾簡(jiǎn)介

1、Pseudo-UTP (Ψ)

假尿苷（Pseudouridine）是RNA上豐富的修飾核苷，又被稱為RNA的“第五種核苷"。mRNA 假尿嘧啶化修飾的過(guò)程是由假尿嘧啶合成酶進(jìn)行催化，讓尿嘧啶核苷酸（U）化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成假尿嘧啶核苷酸。已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個(gè)功能：改變密碼子、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。2005年，Katalin Karikó等人發(fā)現(xiàn)將假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性隨著假尿苷引入比例的增高而降低[2]。2008年，Katalin Karikó等人還發(fā)現(xiàn)用假尿苷*替代尿苷的mRNA不僅能極大地降低mRNA的免疫原性，還能提高mRNA的穩(wěn)定性并增強(qiáng)其翻譯能力[3]。

2、N1-Methylpseudo-UTP (mΨ)

N1-methyl-pseudouridine 是一種甲基假尿苷，通過(guò)增加核糖體密度，mRNA 中的 N1-methyl-pseudouridine 以 eIF2α 依賴性和獨(dú)立機(jī)制增強(qiáng)翻譯。2015年，Oliwia Andries等人發(fā)現(xiàn)用N1-甲基假尿苷*替代尿苷比用假尿苷*替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強(qiáng)mRNA的蛋白表達(dá)能力[4]。

3、N6-Methyl-ATP（m6A）

早在 20 世紀(jì) 70 年代，科學(xué)家們就在 RNA 中發(fā)現(xiàn)了 m6A 修飾，但其功能則由于技術(shù)制約一直未能被很好的揭示。直到 2012 年，科學(xué)家們的研究表明，m6A 修飾和mRNA 的穩(wěn)定性、剪接加工、翻譯以及 microRNA 的加工有關(guān)[5,6]。 2018年，Shinichiro Akichikade等人還發(fā)現(xiàn)在5'-加帽的mRNA帽子上含有92% 的m6Am和8%的Am，可促進(jìn)mRNA的翻譯[7]。

4、5-Methyl-CTP (5mC)

在 mRNA 中，m5C 修飾連同多種效應(yīng)酶，例如 NOP2/Sun RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 2 (NSUN2)、NSUN6,38 tRNA 天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 1 (TRDMT1) 和 Aly/REF 輸出因子 (ALYREF)，執(zhí)行多種功能，包括促進(jìn) mRNA 核胞質(zhì)運(yùn)輸；病毒蛋白表達(dá)； DNA損傷修復(fù)；mRNA 穩(wěn)定性；細(xì)胞耐受性、增殖和遷移；干細(xì)胞的發(fā)育、分化和重編程； mRNA 剪接的調(diào)控[8]。此外，m5C的分布因細(xì)胞類型而異。在mRNA的特定位置上的m5C修飾表現(xiàn)出不同的調(diào)控活性:它們可以促進(jìn)或抑制翻譯[9]。

5、5-Methoxy-UTP(5moU)

5-甲氧基尿苷(5moU) 是一種罕見(jiàn)的核苷，存在于tRNA中。它由β- D-核糖尿嘧啶（糖）和核堿基 5-甲氧基尿嘧啶組成，是尿苷的衍生物。RNA (mRNA) 中加入 5-甲氧基尿苷可以降低所得mRNA 的免疫原性。2022年，Hanieh Moradian等人發(fā)現(xiàn)尿苷的化學(xué)修飾，特別是5moU，顯示出高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，而對(duì)炎性巨噬細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)可忽略不計(jì)[10]。

二、核苷酸修飾應(yīng)用案例

圖2：mRNA的化學(xué)修飾能夠顯著改善表達(dá)，但因細(xì)胞類型和編碼序列而異[1]

核苷酸修飾類型	功能/應(yīng)用
Ψ、mΨ[11]	用N1-甲基假尿苷替代尿苷比用假尿苷替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強(qiáng)mRNA的蛋白表達(dá)能力
mΨ[12,13]	Moderna 疫苗（mRNA-1273）和BioNTech 疫苗（BNT162b）
m6A、Ψ、mΨ、2FdU、5mC、5hmC、5moC和2 2FdC[14]	與未修飾的 mRNA 相比，具有修飾核苷酸的每種 mRNA 減少了 IFN-β 的產(chǎn)生, 逃避或抑制先天性免疫信號(hào)
ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU[15]	五種修飾的FLuc mRNA（ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU-FLuc mRNA）顯著優(yōu)于未修飾的 FLuc mRNA 的活性。
Mψ、5moU、ψ[16]	mRNA的化學(xué)修飾能夠顯著改善蛋白質(zhì)表達(dá)，這取決于細(xì)胞類型和編碼序列。具有mψ、5moU和ψ修飾的eGFP mRNAs在測(cè)試的細(xì)胞系中表達(dá)前三。5moU 修飾的 eGFP mRNA 比其他 eGFP mRNA更穩(wěn)定。

愛(ài)必信提供以下幾種修飾核苷酸

修飾堿基	類型	特點(diǎn)
	假尿苷（Pseudo-UTP；Ψ）、	提高mRNA的穩(wěn)定性、提升翻譯效率、降低免疫原性
	N1-甲基-假尿苷（N1-Methylpseudo-UTP）
	5-甲基-胞苷三磷酸（5-Methyl-CTP）
	5-甲氧基-尿苷三磷酸(5-Methoxy-UTP)
	N6-甲基-腺苷三磷酸(m6A,N6-Methyl-ATP)

修飾核苷酸產(chǎn)品列表

貨號(hào)	名稱	規(guī)格
abs60188	5-甲氧基-CTP鋰鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60169	5-甲氧基-UTP鈉鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60189	5-甲氧基-UTP鋰鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60168	5-甲基-CTP鈉鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60159	ATP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60163	CTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60164	GTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60165	UTP Sodium salt solution（100mM）	1ml×3
abs60186	N1-甲基-假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60156	N1-甲基-假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60187	N6-甲基-ATP鋰鹽溶液	10ul/50ul
abs60158	NTP 鈉鹽混合溶液（含ATP、CTP、GTP、UTP）	1ml×3
abs60185	假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/Pseudo-UTP, lithium salt solution	10ul/50ul/1ml
abs60155	假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/Pseudo-UTP, Sodium salt solution	10ul/50ul/1ml

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[16] US20200172935A1

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