心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞外囊泡具有促炎癥特征并加重心臟損傷
影響因子IF:IF14.976
《Journal of Extracellular Vesicles》
本篇文章使用了愛必信產(chǎn)品abs510006 Human TNF-α ELISA Kit
概述
細(xì)胞外小泡囊泡（EV）抑制重要的生物學(xué)功能。已證明缺血再灌注（IR）誘導(dǎo)心臟中EVs（IR EVs）的釋放增加。然而，IR-EVs在IR病理過程中的作用尚不清楚。本篇文章發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移IR-EV加重IR誘導(dǎo)的心臟損傷，GW4869抑制EV可減輕IR損傷。體內(nèi)和體外研究證實(shí)IR-EVs促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1樣極化，增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，該課題組還公開了心臟EV中的miRNA圖譜，并證實(shí)與假心臟（S-EVs）中的EV相比，IR EVs中的miRNA（如miR-155-5p）富集。特別是，IR-EVs將miR-155-5p轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞，并通過激活JAK2/STAT1途徑增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。有趣的是，IR-EVs不僅促進(jìn)了心臟的局部炎癥，甚至引發(fā)了遠(yuǎn)處器官的全身炎癥。綜上所述，我們?cè)贗R后的心臟中新發(fā)現(xiàn)了IR-EVs-miR-155-5p-M1極化軸。來自IR損傷心臟的EV可引起局部和全身炎癥。重要的是，GW4869抑制EV被認(rèn)為是IR損傷的一種有希望的治療策略。
研究背景
急性心肌梗死（MI）是一個(gè)全球性問題，發(fā)病率和死亡率都很高（Yeh等人，2010年）?？焖倩謴?fù)阻塞的冠狀動(dòng)脈血流是減少心肌梗死面積和改善心功能的*策略。然而，再灌注會(huì)導(dǎo)致不可逆的心肌損傷（Yellon&Hausenloy，2007年），稱為心肌缺血再灌注（IR）損傷（Frank等人，2012年）。心肌缺血再灌注加重了心功能不全，增加了不良預(yù)后的發(fā)生率。然而，IR損傷的機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的治療手段。
炎癥是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基本生物學(xué)過程。然而，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷。心肌梗死后，早期炎癥與梗死區(qū)的最終大小密切相關(guān)（Jose et al.，2014）。巨噬細(xì)胞作為MI引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要效應(yīng)器和調(diào)節(jié)器，參與病原體清除和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的促進(jìn)。巨噬細(xì)胞的極化，如經(jīng)典激活（M1）和替代激活（M2），是實(shí)現(xiàn)這些功能的關(guān)鍵（Murray，2016）。M1巨噬細(xì)胞被稱為促炎型，在吞噬和分泌促炎細(xì)胞因子方面起著重要作用，而M2巨噬細(xì)胞主要參與炎癥的調(diào)節(jié)和受損組織的修復(fù)。MI后促炎性單核細(xì)胞或M1巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有心臟保護(hù)作用（Courties等人，2014年；Harel Adar等人，2011年）。相反，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的極化可以減輕炎癥，防止心肌梗死后心室重構(gòu)不良（Fan等人，2018年；Wei寧斯等人，2014年）。因此，巨噬細(xì)胞在MI和IR損傷中的極化狀態(tài)被認(rèn)為是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
細(xì)胞外囊泡（EV）是細(xì)胞衍生的具有雙層脂膜的納米級(jí)囊泡（Abels&Breakefield，2016）。越來越多的證據(jù)證實(shí)了電動(dòng)汽車作為小區(qū)間通信工具的重要作用（Tkach&Théry，2016）。最近的研究揭示了它們?cè)谘装Y調(diào)節(jié)中的作用，并通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化證實(shí)了它們參與了各種疾病的發(fā)展（Lv等人，2020年；Wang等人，2020年；Yin等人，2020年）。我們之前證明了IR后心臟EV釋放顯著增加（Ge等人，2019年）。然而，IR誘導(dǎo)EV（IR EV）的作用仍有待揭示。大量研究表明，非編碼RNA（ncRNA）在心血管疾病中起著重要作用（Beermann等人，2016），尤其是miRNA（Karakas等人，2016；Leistner等人，2016；Mcdonald等人，2015；Zhang等人，2017）。EV可以將特定分子如miRNA（Bang等人，2014；Okoye等人，2014）轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中以調(diào)節(jié)其功能，從而參與發(fā)病機(jī)制。在小鼠心肌梗死模型中，循環(huán)EVs中的心肌微RNA動(dòng)員了骨髓祖細(xì)胞，介導(dǎo)了對(duì)心臟損傷的系統(tǒng)反應(yīng)（Cheng等人，2019年）。然而，心臟IR-EV和EV介導(dǎo)的miRNAs是否以及如何在IR損傷中發(fā)揮作用尚不清楚。目前的研究表明IR-EVs加重了IR后的心臟損傷，早期抑制IR-EVs可能是一種有前途的策略。有趣的是，IR-EVs不僅導(dǎo)致IR損傷心臟的無菌性炎癥，甚至誘發(fā)遠(yuǎn)處器官的全身性炎癥。特別是，我們鑒定了心臟EV中的miRNA圖譜，并揭示了心臟IR期間IR EV–miR-155-5p–M1極化軸。
實(shí)驗(yàn)過程
1. 建立了小鼠心肌IR模型。
2. 細(xì)胞外囊泡分離、獲得懸浮液
3. 透射電子顯微鏡檢測(cè)EV樣品
4. 納米顆粒跟蹤分析（NTA）
5. 超聲心動(dòng)圖進(jìn)行評(píng)估心臟功能
6. 心肌酶檢測(cè)和循環(huán)白細(xì)胞收集
7. 再灌注24小時(shí)后處死小鼠。2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色，Image Pro Plus分析。
8. 小鼠心臟切片免疫熒光染色
9. DiI標(biāo)記的EV與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。DAPI細(xì)胞核染色。共聚焦成像。
10. IR-EV用脂質(zhì)體染料DiR預(yù)先染色，心臟內(nèi)或尾靜脈注射DiR標(biāo)記的EVs。使用IVIS成像系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)光成像。
11. 小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）和腹腔巨噬細(xì)胞（PMφ）的分離和培養(yǎng)
12. 檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。
13. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心臟巨噬細(xì)胞的表型。
14. 體外microRNA轉(zhuǎn)染
15. 體內(nèi)microRNA給藥
16. 制備miRNA測(cè)序文庫并在Illumina HiSeq測(cè)序儀上測(cè)序
17. RT-qPCR
18. ELISA檢測(cè)蛋白質(zhì)水平
19. Western blot
20. 統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. IR引起的心臟EV改變
在TEM下捕獲了來自假心臟或IR損傷心臟的EV的典型形態(tài)（圖1a）。如圖1b所示，假手術(shù)組（S-EVs）和IR-EVs中表達(dá)了典型的外顯子標(biāo)記物，包括CD63、CD9、Alix和TSG101。心肌IR顯著增加了EV的心內(nèi)釋放（圖1c和d），但并未顯著調(diào)節(jié)EV的大?。▓D1e）。
圖1心臟電動(dòng)汽車的特征。
[（a）假手術(shù)（S-EVs）和IR EVs的代表性TEM圖像，（bar=50 nm）。（b）EVs的蛋白質(zhì)免疫印跡，包括四種典型的外體標(biāo)記物（Alix、Tsg101、CD63和CD9）。（c）使用納米顆粒追蹤分析（NTA）測(cè)量心臟EVs的粒徑分布。（d）（c）對(duì)從假手術(shù)和IR損傷心臟分離的EV進(jìn)行量化。（e） NTA在（c）中檢測(cè)到的EV尺寸，P＜0.01；ns，不顯著]
2. IR-EVs加重IR誘導(dǎo)的心臟損傷，促進(jìn)IR損傷心臟巨噬細(xì)胞M1極化
我們之前的研究表明，心肌缺血再灌注后心臟EV釋放增加（Ge等人，2019年）。為了進(jìn)一步闡明IR EV在心臟IR損傷中的作用，將IR EV輸注到假心臟或IR損傷心臟（圖2a）。生物發(fā)光成像顯示，心臟內(nèi)注射DiR標(biāo)記的IR EV后24小時(shí)，IR EV可保留在心臟內(nèi)（圖2b）。更重要的是，與接受PBS載體的患者相比，輸注IR EV顯著損害心臟功能（圖2c-e）并增加梗死面積（圖2f和g）。與IR+PBS小鼠相比，IR+IR EVs組小鼠顯示出更高水平的心肌酶（圖2h）。這些結(jié)果表明IR EVs加重了IR誘導(dǎo)的心臟損傷。
圖2.IR EVs輸血加重IR損傷，促進(jìn)心臟巨噬細(xì)胞M1極化。
[（a）注射IR EV和組織采集的方案示意圖。（b）生物發(fā)光成像證實(shí)，通過心臟內(nèi)注射DiR標(biāo)記的IR EV，IR EV保留在心臟內(nèi)。（c）代表性超聲心動(dòng)圖。（d）EF值。（e）FS值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=6）。（f）在IR EVs或PBS輸注后1天處死的小鼠的代表性TTC染色心臟。（g） （f）中梗死面積（以梗死面積（I）/左心室（LV）面積表示）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=6）。（h）血漿心肌酶水平，包括AST、LDH、CK和CK-MB（n=8,8,12,12）。（i）心臟中NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)。（j）M2極化相關(guān)基因Arg1、MRC1、Fizz1和IL10在心臟中的表達(dá)。趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2在（k）心臟和（l）循環(huán)白細(xì)胞中的表達(dá)。（m）典型的免疫熒光圖像顯示心臟內(nèi)有CD45+炎性細(xì)胞和CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞。（n）心臟免疫熒光圖像中CD45+炎性細(xì)胞（每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（o）心臟免疫熒光圖像中CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞（每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（p）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定心臟巨噬細(xì)胞極化。（q） 心臟中CD86+M1極化巨噬細(xì)胞的百分比。（r）心臟中CD206+M2極化巨噬細(xì)胞的百分比，P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
巨噬細(xì)胞極化在IR誘導(dǎo)的心臟損傷和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。接下來，我們?cè)噲D確定IR EVs是否能增強(qiáng)炎癥并調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的極化。圖2i顯示IR-EV輸血顯著增強(qiáng)了IR損傷心臟中M1極化標(biāo)記基因NOS2和促炎細(xì)胞因子IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)。而M2極化相關(guān)的Arg1、MRC1、Fizz1和IL10的mRNA水平顯著降低（圖2j）。明顯地，IR EVs輸注增強(qiáng)了包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2在內(nèi)的趨化因子在IR損傷小鼠心臟和循環(huán)白細(xì)胞中的表達(dá)（圖2k和l）。IR EVs不增強(qiáng)促炎因子的表達(dá)，如IL1β和IL6（圖S1A和B），但降低IR損傷小鼠循環(huán)白細(xì)胞中IL10的表達(dá)（圖S1C）。心臟組織的免疫熒光染色顯示，IR-EV輸血促進(jìn)了假手術(shù)和IR損傷小鼠體內(nèi)CD45+炎性細(xì)胞以及CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖2m-o）。先前的研究強(qiáng)調(diào)了Cxcl2在感染期間促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的作用（Lentini等人，2020年）。除巨噬細(xì)胞外，我們還觀察到用IR EVs治療的IR小鼠中性粒細(xì)胞募集增加（圖S2A-C）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，IR EVs增加了假手術(shù)和IR損傷心臟組織中CD86+（M1標(biāo)記）巨噬細(xì)胞的比例，并降低了CD206+（M2標(biāo)記）巨噬細(xì)胞的百分比（圖2p-r）。這些結(jié)果證實(shí)了IR誘導(dǎo)的心臟EV加劇了局部炎癥。值得注意的是，IR EV促進(jìn)巨噬細(xì)胞滲入受損心臟，并在心臟IR期間促進(jìn)其M1極化。
3.抑制EV產(chǎn)生可減輕心肌IR損傷并減輕局部炎癥
接下來，我們使用GW4869，一種廣泛使用的EV/外體生物發(fā)生化學(xué)抑制劑（Menck等人，2017年；Xiao等人，2018年），探索EV抑制對(duì)IR誘導(dǎo)的心臟損傷的影響（圖3a）。首先，我們確認(rèn)通過腹腔注射GW4869預(yù)處理降低了IR誘導(dǎo)的心臟EV生成（補(bǔ)充圖3）。與接受溶媒注射的IR小鼠相比，服用GW4869可顯著改善IR損傷小鼠的心功能（圖3b-d），減少梗死面積（圖3e-f），并降低IR小鼠的心肌酶水平（圖3g）。此外，我們發(fā)現(xiàn)GW4869治療顯著抑制IR損傷心臟中NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)（圖3h），并上調(diào)Arg1、MRC1和Fizz1的水平（補(bǔ)充圖4A-C）。類似地，與IR小鼠相比，經(jīng)GW4869治療的IR小鼠心臟中促炎性趨化因子（包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2）的表達(dá)減少（圖3i）。持續(xù)地，GW4869治療減少了IR損傷心臟中CD45+炎性細(xì)胞以及CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖3j-l）。GW4869抑制IR-EV的心臟保護(hù)作用進(jìn)一步表明，IR誘導(dǎo)的EV參與心臟IR損傷，并有助于增強(qiáng)炎癥。
圖3.GW4869治療減輕IR損傷并減輕局部炎癥。
[（a）GW4869治療和組織采集的方案示意圖。（b）代表性超聲心動(dòng)圖，（c）EF值和（d）FS值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（n=6）。（e）IR后1天GW4869或DMSO治療小鼠的代表性TTC染色心臟。（f）梗死面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（以梗死面積（I）表示）/左心室（LV）面積（e）（n=6）。（g） 血漿心肌酶水平，包括AST、LDH、CK和CK-MB（n=8、8、12、12）。（h）M1極化相關(guān)基因（包括NOS2、IL1β、IL6和TNFα）和（i）促炎癥趨化因子（包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2）在接受GW4869治療的IR小鼠心臟中的表達(dá)。（j） 用抗CD45和抗F4/80抗體染色的心臟的代表性免疫熒光圖像。（k） 心臟免疫熒光圖像中CD45+炎性細(xì)胞（每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（l） 心臟免疫熒光圖像中CD45+F4/80+巨噬細(xì)胞（每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.000
4.IR-EVs體外編程巨噬細(xì)胞向M1樣極化
為了進(jìn)一步闡明IR-EVs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用，應(yīng)用原代腹腔巨噬細(xì)胞并與IR-EVs共培養(yǎng)。首先，添加IR EV促進(jìn)M1極化相關(guān)基因的表達(dá)，包括NOS2、IL1β、IL6和TNFα（圖4a和圖S5A和C），并降低M2極化相關(guān)基因的表達(dá)，如MRC1、Fizz1和IL10（圖4b和圖S5B）。經(jīng)典促炎因子（包括IL1β、IL6和TNFα）的蛋白質(zhì)水平也證實(shí)了一致的結(jié)果（圖4c）。在IR-EV刺激24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL6的釋放持續(xù)增加（圖S5D）。此外，NOS2（圖4d）、IL1β、IL6和TNFα（圖4e）的mRNA水平隨著EVs在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中濃度的增加而逐漸上調(diào)。此外，我們還探討了IR-EVs對(duì)體外產(chǎn)生趨化因子的影響。趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2均在mRNA水平顯著增加，尤其是Cxcl2（圖4f和圖S6）。與未治療組相比，高水平IR EV（>109/ml）導(dǎo)致趨化因子的高表達(dá)，尤其是Cxcl2（圖4g）。我們的體內(nèi)外結(jié)果表明，IR后大量IR EV的釋放可能是促進(jìn)趨化因子和炎癥因子產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)因素之一。此外，IR EVs治療顯著提高了吞噬相關(guān)基因的表達(dá)（圖4h），并促進(jìn)了PMφ和BMDM的吞噬活性（圖4i）。
圖4.IR EV促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1樣極化。
[經(jīng)IR EVs或PBS過夜處理的巨噬細(xì)胞中（a）M1極化相關(guān)基因和（b）M2極化相關(guān)基因的表達(dá)。（c）經(jīng)IR EVs或PBS過夜處理的巨噬細(xì)胞分泌IL1β、IL6和TNFα。（d）經(jīng)梯度濃度（0、108、109和1010/ml）處理的巨噬細(xì)胞中NOS2的表達(dá)）IR電動(dòng)汽車的一夜之間。（e） IR-EV濃度與經(jīng)IR-EVs處理的巨噬細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)呈正相關(guān)。（f） 不同時(shí)間（0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)）IR EVs處理的巨噬細(xì)胞中趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達(dá)。（g） 用梯度濃度的IR EVs處理過夜的巨噬細(xì)胞，其趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達(dá)。（h） 不同時(shí)間（0小時(shí)、3小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)）IR-EVs處理的巨噬細(xì)胞中吞噬相關(guān)基因的表達(dá)。（i） 吞噬試驗(yàn)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞（PMφ）和骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）的吞噬功能。這些數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
5.miR-155-5p作為IR-EV介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的候選效應(yīng)物
電動(dòng)汽車通過提供miRNA而被稱為細(xì)胞間通信載體。因此，我們對(duì)來自假手術(shù)（S-EVs）和IR損傷心臟的EV進(jìn)行RNA序列分析，以確定候選的miRNA效應(yīng)子。鑒定了差異表達(dá)的miRNA（圖5a和表S3），IR EV中前面10個(gè)高表達(dá)的miRNA也通過qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證，包括miR-155-5p、miR-484、miR-7a-5p、miR-132-3p、miR-181d-5p、miR-432-5p、miR-652-3p、miR-15b-5p和2個(gè)新的miRNA:miR-novel-chr7_40384和miR-novel-chr7_40362（圖5b）。共聚焦顯微鏡的結(jié)果顯示IR EV可被巨噬細(xì)胞攝取，這始終體現(xiàn)了載體特性（圖5c）。為了進(jìn)一步確定IR EV介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的候選miRNA，在與IR EVs共培養(yǎng)的PMφ中檢測(cè)前三個(gè)高表達(dá)miRNA（miR-155-5p、miR-484和miR-novelR-CHR740384）。值得注意的是，與S-EV培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比，IR-EV培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中miR-155-5p顯著上調(diào)（圖5d）。此外，IR EVs的濃度與共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)呈正相關(guān)（圖5e和f）。有趣的是，高濃度的IR EV（1010/ml）同時(shí)增加了pri-mir155的表達(dá)（圖5g）。一致地，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與循環(huán)假EV相比，循環(huán)IR EV中高濃度的miR-155-5p（補(bǔ)充圖7a）。心臟IR EV中的低表達(dá)miRNA，如miR-9-5p和miR-151-3p，在循環(huán)IR EV中也減少（圖S7B和C）。因此，miR-155-5p可作為IR EVs中關(guān)鍵監(jiān)管貨物的有力候選。
圖5.MiR-155-5p可以從IR EV轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞。
[（a）熱圖顯示S-EV和IR-EV之間差異表達(dá)的miRNA。（b）通過qPCR驗(yàn)證IR-EV中顯著高表達(dá)的miRNA。（c）共聚焦圖像顯示PMφ在與DiI標(biāo)記的EV共培養(yǎng)24小時(shí)后攝取IR-EV。（d）qPCR用于評(píng)估3種富含IR-EV的miRNA的表達(dá)，包括經(jīng)PBS、S-EVs或IR-EVs處理不同時(shí)間（0小時(shí)、3小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)）的PMφ中的miR-484、miR-155-5p和一種新的miRNA（miR-novel）。（e） 增加IR EV濃度可導(dǎo)致經(jīng)治療巨噬細(xì)胞中miR-155-5p的劑量依賴性增加。（f） IR-EV濃度與IR-EV處理的巨噬細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)呈正相關(guān)。（g） pri-mir155在梯度濃度IR EVs處理24小時(shí)后巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
6.IR EVs中的miR-155-5p通過JAK2/STAT1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化
除了在與IR EV共培養(yǎng)的PMφ中顯著增加NOS2表達(dá)外，我們進(jìn)一步證實(shí)IR-EV濃度與NOS2表達(dá)之間存在正相關(guān)性（圖6a）。同時(shí)，在IR-EV-共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中，miR-155-5p表達(dá)與NOS2表達(dá)呈正相關(guān)（圖6b）。miR-155-5p模擬物的轉(zhuǎn)染增加了促炎因子的表達(dá)（圖6c-e），并降低了抗炎細(xì)胞因子IL10的表達(dá)（圖6f）。此外，心內(nèi)注射agomiR-155可復(fù)制IR EVs的促炎癥作用，增加IR損傷心臟中IL1β、IL6和TNFα的表達(dá)（圖6g-i），降低IL10的表達(dá)（圖6j）。先前的研究表明JAK/STAT1是巨噬細(xì)胞M1極化的重要調(diào)節(jié)途徑（Jin等人，2020年；墨爾本等人，2020年）。如圖6k和l所示，IR EVs顯著提高PMφ中總JAK2和磷酸化JAK2（p-JAK2）的表達(dá)。下游分子STAT1在IR-EV-共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中也被激活。類似地，添加miR-155-5p模擬物激活巨噬細(xì)胞中的JAK2/STAT1通路（圖6m和n）。此外，miR-155-5p模擬物進(jìn)一步增強(qiáng)IR EV誘導(dǎo)的JAK2/STAT1激活，miR-155-5p抑制劑抵消了巨噬細(xì)胞中IR EV誘導(dǎo)的p-JAK2和p-STAT1蛋白的升高（圖6o和p）。這些結(jié)果表明，miR-155-5p通過JAK2/STAT1激活促進(jìn)IR-EV調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞M1極化。
圖6.miR-155-5p通過激活JAK2/STAT1通路促進(jìn)M1極化。
[（a）IR-EV處理的巨噬細(xì)胞中IR-EV濃度與NOS2表達(dá)呈正相關(guān)。（b）IR-EV處理的巨噬細(xì)胞中miR-155-5p表達(dá)與NOS2表達(dá)呈正相關(guān)。促炎因子（c）IL1β，（d）IL6，（e）TNFα和（f）的表達(dá)用miR-155-5p模擬物處理PMφ中的IL10。體內(nèi)給予agomiR-155可增加IR損傷心臟中促炎細(xì)胞因子（g）IL1β，（h）IL6，（i）TNFα的表達(dá)，并降低抗炎細(xì)胞因子（j）IL10的表達(dá)。（k） Western印跡證實(shí)，IR-EV（0、108、109和1010/ml）處理可激活JAK2和STAT1蛋白。（l） （k）中免疫印跡條帶強(qiáng)度的量化數(shù)據(jù)。（m） 通過western blot評(píng)估，巨噬細(xì)胞中MiR-155-5p（0，100200，500 nM）過表達(dá)激活JAK2和STAT1蛋白。（n） 免疫印跡條帶強(qiáng)度的定量數(shù)據(jù)（m）。（o） Western blotting證實(shí)miR-155-5p模擬物進(jìn)一步增強(qiáng)IR EVs誘導(dǎo)的JAK2/STAT1激活，miR-155-5p抑制劑抵消了巨噬細(xì)胞中IR EVs誘導(dǎo)的p-JAK2和p-STAT1蛋白的升高。（p） （o）中免疫印跡條帶強(qiáng)度的量化數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
7.IR EV可導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官的全身炎癥
為了進(jìn)一步探索IR EV是否在其他器官發(fā)揮作用，我們首先確認(rèn)心肌IR損傷觸發(fā)循環(huán)中EV釋放增加（圖S8A）。此外，IR損傷促進(jìn)了IR后1天循環(huán)中促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌（圖7a）。除心臟組織外，在遠(yuǎn)處器官，包括肺、肝、腎和脾，促炎基因的表達(dá)也增加（圖7b）。此外，GW4869治療減少了IR損傷小鼠循環(huán)中促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的釋放（圖7c），并減少了遠(yuǎn)端器官中由心肌IR誘導(dǎo)的促炎基因的表達(dá)（圖7d）。至于腦組織，心臟IR損傷僅造成微弱的促炎作用（圖S8B），我們?cè)贗R損傷小鼠的大腦中未發(fā)現(xiàn)GW4869治療的顯著抗炎作用（圖S8C）。
圖7.IR EV可引發(fā)遠(yuǎn)處器官的全身炎癥。
[（a）心肌IR損傷促進(jìn)血液中促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌。（b）心肌IR損傷誘導(dǎo)遠(yuǎn)處器官中促炎基因表達(dá)增加。（c）GW4869治療減少促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子的釋放（Cxcl1和Cxcl2）在IR損傷小鼠的循環(huán)中。（d） GW4869治療可降低遠(yuǎn)端器官心肌IR誘導(dǎo)的促炎基因的表達(dá)。（e） 生物發(fā)光成像顯示靜脈注射DiR標(biāo)記的EVs后24小時(shí)IR-EVs在器官間的分布。（f） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時(shí)血液中促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌。（g） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時(shí)循環(huán)白細(xì)胞中促炎基因的表達(dá)。（h） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時(shí)，促炎基因在不同器官中的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
最近的研究強(qiáng)調(diào)EV是不同病理過程中的遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)分子（Thomou等人，2017年；Whitham等人，2018年）。生物發(fā)光成像證實(shí)，在向正常小鼠靜脈注射DiR標(biāo)記的EV 24小時(shí)后，IR EV存在于各種器官中（圖7e和圖S8d）。接下來，我們證明靜脈注射IR EVs可增加循環(huán)中促炎細(xì)胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的釋放（圖7f）。靜脈注射IR EVs后，循環(huán)白細(xì)胞中促炎基因的表達(dá)也升高（圖7g）。一致地，通過靜脈注射IR EVs在不同器官中發(fā)現(xiàn)類似的促炎作用（圖7h和圖S8E）。此外，IR EV的施用上調(diào)了多個(gè)器官中CD45+和CD45+F4/80+細(xì)胞的表達(dá)，尤其是在EV富集的器官中，如肺和肝（圖S9）。這些發(fā)現(xiàn)表明，IR EV在心臟IR損傷期間促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)。
總結(jié)
心肌IR引起心臟EV的大量釋放。這些IR誘導(dǎo)EV（IR EV）促進(jìn)IR損傷心臟的局部無菌性炎癥，并可通過引發(fā)全身炎癥的循環(huán)分流至遠(yuǎn)處器官。值得注意的是，IR EVs可將miR-155-5p輸送至巨噬細(xì)胞，并通過激活JAK2/STAT1通路促進(jìn)促炎癥表型。GW4869抑制EV可降低局部和全身炎癥，并顯著減輕IR誘導(dǎo)的心臟損傷。
圖8.IR誘導(dǎo)的EV在心肌IR損傷中的作用示意圖。
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