ELISA實(shí)驗(yàn)做不好？我們?yōu)槟鷧R總了常見(jiàn)的30個(gè)問(wèn)題?。ǘ?/h1>

更新時(shí)間：2020-03-23      點(diǎn)擊次數(shù)：3222

上一期我們?yōu)榇蠹覅R總了ELISA實(shí)驗(yàn)原理、樣本準(zhǔn)備和預(yù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)的十個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題及解答，可能有心急的小伙伴早就想要了解更多后續(xù)關(guān)于ELISA實(shí)驗(yàn)方面的問(wèn)題了，不要走開(kāi)，接下來(lái)將給您帶來(lái)相關(guān)解答~
 

Q：in vivo實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不太好做預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)ELISA結(jié)果會(huì)有影響么？怎么辦？

A：如果您實(shí)驗(yàn)室之前建立的in vivo實(shí)驗(yàn)protocol經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可以保證有效性，那么，可以不用再進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)；并且，如果實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，樣本獲取不易，同時(shí)又需要檢測(cè)較多指標(biāo)，建議將樣品分裝凍存，避免反復(fù)凍融。ELISA實(shí)驗(yàn)還是建議進(jìn)行一下預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸清楚樣本的佳稀釋比例，取得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

Q：檢測(cè)樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對(duì)炎癥因子的濃度有影響嗎？

A：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。因不同處理，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)不同，要保證在鋪板時(shí)接種細(xì)胞數(shù)量水平一致。

 

Q：打開(kāi)試劑盒，發(fā)現(xiàn)wash buffer析出結(jié)晶，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響么？怎么辦？

A：wash buffer為高濃度鹽溶液，在低溫保存條件下，有可能出現(xiàn)結(jié)晶析出，為正?，F(xiàn)象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的結(jié)晶會(huì)溶解，溶解后可正常使用。不可以在結(jié)晶存在的情況下配置wash buffer。
 

Q：愛(ài)必信的ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

A：HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為T(mén)MB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)背景升高，或無(wú)法使用，所以愛(ài)必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測(cè)是否為無(wú)色透明，如果是正常的，對(duì)結(jié)果也沒(méi)有影響，可以放心使用。
 

Q：同一樣品多次ELISA檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果差異大怎么解決？

A：應(yīng)考慮的問(wèn)題包括：

• 樣本保存不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大，樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測(cè)，需在取樣后分裝保存；
• 樣品凍融之后未混勻，應(yīng)混勻后再上樣；
• 加樣不準(zhǔn)確，微量樣品加樣時(shí)要注意移液器槍頭不要有殘留。

 

Q：副孔差別比較大，是沒(méi)洗干凈嗎？

A：復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確，洗板過(guò)程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應(yīng)注意移液器量程，以及槍頭殘留問(wèn)題；洗板過(guò)程應(yīng)注意不要有殘留液體，需要進(jìn)行拍干操作；孵育過(guò)程要更換封板膜，拍干過(guò)程要換吸水紙，避免交叉污染。
 

Q：加完終止液之后測(cè)的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大，是什么原因？

A：加完終止液后，顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止，形成的黃色顏色會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。
 

Q：整個(gè)過(guò)程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

A：ELISA實(shí)驗(yàn)中，在酶標(biāo)抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無(wú)需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€(gè)ELISA板子放入暗盒或抽屜等無(wú)光處即可。
 

Q：封板膜什么時(shí)候用？每次加液后都要換嗎？

A：封板膜在孵育樣品、檢測(cè)抗體以及HRP酶標(biāo)抗體時(shí)，都要蓋好封板膜，減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。
 

Q：ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟如果沒(méi)有洗板機(jī)，需要如何操作？

A：實(shí)驗(yàn)室ELISA實(shí)驗(yàn)做的較多，還是建議使用洗板機(jī)洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒(méi)有洗板機(jī)，在洗板過(guò)程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復(fù)三次。
 

Q：手動(dòng)洗板過(guò)程中，拍過(guò)抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

A：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 

今天的FAQ就到這里啦，小編在這里做個(gè)總結(jié)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中重要的就是上樣、孵育和洗板，上樣要注意樣本混勻、加樣準(zhǔn)確，孵育要蓋好封板膜，避免交叉污染，洗滌則要避免液體殘留，建議洗板機(jī)洗板，并且要拍干。注意這些細(xì)節(jié)問(wèn)題，相信各位同學(xué)肯定可以得到好的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下期我們?cè)俳o您帶來(lái)ELISA數(shù)據(jù)獲取及處理方面的一些問(wèn)題，感興趣的小伙伴們繼續(xù)關(guān)注吧~

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