【愛必信實驗小貼士】免疫組織化學(xué)

一、定義：

細胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。

二、分類：

根據(jù)染色在整個制片中的位置分為：包埋前染色、包埋后染色；

根據(jù)標(biāo)記物種類分為：免疫熒光法、免疫過氧化物酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法；

按標(biāo)記物的位置分為：

    直接法：標(biāo)記物結(jié)合在直接與組織抗原發(fā)生免疫結(jié)合的特異性抗體，即抗體上；

    間接法：標(biāo)記物通過其所標(biāo)記的非特異抗體，即第二抗體間接地與抗體結(jié)合；

    標(biāo)記物——抗體復(fù)合法。

三、原理：

免疫組化染色是引入附有標(biāo)記物的外源性抗體（或抗原），使之錨定于組織或細胞標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（或抗體）部位，標(biāo)記物經(jīng)呈色反應(yīng)而顯示待檢抗原（或抗體）。

四、主要過程：

1、脫蠟水化：

切片在脫蠟前，放在APES（防止脫片用的，缺點是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘，然后將組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯再浸泡10min，無水乙醇浸泡 10min，更換無水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，后用蒸餾水浸泡 5min；

2、清洗：先用蒸餾水溫柔的沖洗一會，更換PBS沖洗5min，再用PBS沖洗5min；

3、抗原修復(fù)：

（1）微波爐加熱：適用于來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動物種屬的組織標(biāo)本；

（2）高壓熱修復(fù)：適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)；

（3）酶消化方法：適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement. Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

4、封閉：用和二抗來源一致的血清在保濕盒中于37℃孵育15-30min，然后甩去封閉用血清；

5、一抗孵育：

滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，將切片放在保濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育或者溫箱37℃孵育1-2個小時。

6、清洗：過夜后的切片用PBS沖洗2，沖洗3次；

7、二抗孵育：

滴加標(biāo)記二抗在保濕盒中于37℃孵育30分鐘。

8、清洗：切片用PBS沖洗2min，沖洗3次；

9、顯色：加入顯色劑顯色，根據(jù)顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時間一般都在3-10min左右，常用5min。

10、沖洗：充分沖洗10-15min,

11、復(fù)染

12、脫水透明

依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，后用100%酒精浸泡10min，更換酒精浸泡10min，后用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯，再浸泡10min；

13、封片

撈出，用樹脂封片，一滴/張,在其上蓋上小玻片封好的組織切片，放入超凈臺中，打開抽風(fēng)，沖一段時間，后把切片放在窗臺上涼2-3天。

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